黄芪诱导大鼠骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化的实验研究.pdfVIP

王 黄芪诱导大鼠骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化的实验研究 王新生 崔慧先 李志鹏 薄爱华 (河北医科大学解剖教研室，河北 石家庄 050017) [摘 要] 目的 观察黄芪注射液诱导大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)分化的特点。方法 使用稀释浓度为200 mg／ml的黄芪注射液诱导 BMSCs,分别在1、3、6 d倒置显微镜观察细胞形态变化，免疫细胞化学方法观察巢蛋白(nestin)、神经元特异性烯醇化酶(NSE)、神经胶质纤维酸性蛋 白(GFAP)、微管相关蛋白-2(MAP-2)的表达。结果 诱导后可见细胞形态发生改变，自胞体长出突起，随诱导时间延长，长出突起的细胞数量增多， 突起进一步伸长，部分突起末端呈分叉状，可见网络状连接。免疫细胞化学示：nestin阳性细胞、NSE阳性细胞和GFAP阳性细胞在诱导第3天较多， MAP-2阳性细胞在第6天较多。结论 黄芪首先诱导BMSCs向神经干细胞分化，然后促进其向神经元或神经胶质细胞的非特异性分化，并促进已分 化的细胞进一步成熟、老化。 [关键词] 黄芪；骨髓问充质干细胞；神经干细胞 [中图分类号] 11285．5 [文献标识码] A [文章编号] 1005-9202(2008)11-1067-03 骨髓间充质干细胞(bone malTow mesenchymal stem cells， 冻存备用。 BMSCs)是较早被认识的成体干细胞(adult stem cells)之一，具 1．4 BMSCs向神经元样细胞的诱导 取第4代的BMSCs，以 有多向分化潜能，可以向骨、软骨、脂肪细胞、肝细胞、内皮细胞 4×10 ／ml的浓度接种于放置有盖玻片的12孔板内，培养液为 以及神经元样细胞分化，使其成为最易获得的可向3个胚层分 含15％胎牛血清的L—DMEM，置于37℃、5％CO 培养箱内培养 化的成体干细胞之一，其多向分化潜能可与胚胎干细胞相媲 制备细胞爬片。盖玻片上细胞达到80％一90％融合后，全量换 美 0]。近年来中药制剂诱导BMSCs分化为神经元样细胞取 液，加入诱导培养基(诱导培养基为：200 mg／ml黄芪注射液+ 得了很大进展 ]。为积累实验资料和拓宽中药及其制剂的应 L—DMEM+15％胎牛血清)诱导，对照组不加黄芪注射液。诱导 用，我们对黄芪注射液诱导BMSCs分化的特点进行了观察，以 时间分为：1、3、6 d。 期为中药辅助干细胞移植治疗帕金森病和老年痴呆症等老年 1．5 BMSCs的诱导鉴定 采用免疫细胞化学方法观察nestin、 性神经退化性疾病的研究奠定基础。 NSE、MAP．2、GFAP等特异性标志物的表达。对照组设阴性对 照和阳性对照，阴性对照用PBS液代替一抗，阳性对照采用正 1 材料与方法 常大鼠脑切片免疫组化结果。免疫细胞化学步骤为：细胞爬片 1．1 实验动物 6 W龄清洁级 Wistar雄性大鼠1只，体重 用4％多聚甲醛固定20 min；山羊血清封闭5 min；加入一抗， 200 g，购自中国医科院实验动物中心。 4℃过夜；加入生物素标记的二抗，室温20 min；再加入链霉亲 1．2 主要试剂 L—DMEM(Gibco)，胎牛血清(天津市川I贝生 和素复合体，室温孵育20 min；DAB显色，中性树胶封片。以细 化制品有限公司出品，批号：060406)；黄芪注射液(大理药业有 胞内出现棕黄色颗粒状着色为阳性，未着色为阴性。在每个实 限公司，批号：060105)；兔抗巢蛋白(nestin)，兔抗神经元特异 验组中，随机选取6个视野，计数6个视野中阳性细胞总数和 性烯醇化酶(NSE)，小鼠抗微管相关蛋白_2(MAP一2)，兔抗神经 总细胞数，以公式：阳性率=(阳性细胞数／总细胞数)×100％ 胶质纤维酸『生蛋白(GFAP)，SABC试剂盒，DAB试剂盒均购自 计算阳性细胞率。 武汉博士德公司。 1．6 统计方法 使用SAS6．O1软件，采用Calculate tests o