实验三 考马斯亮蓝G-250法测定蛋白质含量.DOCVIP

实验 考马斯亮蓝G-250法测定蛋白质含量 学习和掌握考马斯亮蓝G-250测定蛋白质含量的原理和方法。 二、原理 考马斯亮蓝G-250（Coomassie brilliant blue G-250）测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。考马斯亮蓝G-250在游离状态下呈红色，当它与蛋白质结合后变为青色，前者最大光吸收在465nm，后者在595nm。在一定蛋白质浓度范围内（0~1000微克/毫升）蛋白质—色素结合物在595nm波长下的光吸收与蛋白质含量成正比，因此可用于蛋白质的定量测定。蛋白质与考马斯亮蓝G-250结合在2min左右的时间内达到平衡，完成反应十分迅速；其结合物在室温下1h内保持稳定。该反应非常灵敏，可测定微克级蛋白质含量，所以是一种比较好的蛋白质测定方法。 三、仪器和试剂 （一）、仪器 1、723型分光光度计 2、离心机刻度吸管 3、分析天平 4、药物天平 5、量筒：10毫升×1 6、研钵 7、烧杯 8、量瓶：10毫升×1 9、刻度吸管：1毫升×2，0.1毫升×2 10、具塞刻度试管：10毫升×14 11、漏斗 12、剪刀 （二）、试剂： 1、牛血清白蛋白 2、考马斯亮蓝G-250 3、乙醇 4、磷酸（85％） 四、操作步骤 （一）、标准曲线制作 （1）0～1000微克／毫升标准曲线的制作：取6支试管，按下表数据配制0～1000微克／毫升牛血清蛋白溶液各1毫升： 管号 1 2 3 4 5 6 1000微克／毫升牛血清白蛋白量（mL） 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 蒸馏水量（mL） 1.0 0．8 0．6 0．4 0．2 0 蛋白质含量（微克） 0 200 400 600 800 1000 准确吸取所配各管溶液0.1毫升，分别放入10毫升具塞氏管中， 加入考马斯亮蓝G—250 蛋白试剂，盖塞，将各试管中溶液纵向倒转混合，放置2min后用1cm光经的比色杯在595nm波长下比色。做出标准曲线。 （二）、样品提取液中蛋白质浓度的测定： 称取新鲜绿豆芽下胚轴2g放入研钵中，加2mL蒸馏水研磨成匀浆，转移到离心管中，再用6mL蒸馏水分次洗涤研钵，洗涤液收集于同一离心管中，放置0.5～1h以充分提取，然后在4 000r/min离心10min，弃去沉淀，上清液转入10mL刻度试管，以蒸馏水定容至10ml待测。 测定：吸取提取液0.1mL（需做一重复），放入具塞刻度试管中，加入5mL考马斯亮蓝G-250蛋白试剂，充分混合，放置2min后用1cm光径比色杯在595nm下比色，记录消光值，并通过标准曲线查得待测样品提取液中蛋白质的含量。以标准曲线1号试管做空白。 五、结果与计算 ? 式中：A为在标准曲线上查得的蛋白质含量,单位为微克。 六、附 注 1、蛋白质标准溶液的配制：称取100mg牛血清白蛋白，溶于100mL蒸馏水中，即为1 000微克／毫升的原液。 2、考马斯亮蓝G-250的配制：称取100毫克考马斯亮蓝G-250，溶于50mL 90％乙醇中，加入85％（W／V）的磷酸100mL，最后用蒸馏水定容到1 000mL。此溶液在常温下可放置一个月。 样品蛋白含量（μg / g鲜重）= 提取液总体积（mL） 测定取用体积（mL） A × 　　样品量（ｇ）