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题目:多杀菌素发酵工艺的优化及其毒性初步研究摘要：对刺糖多孢菌S-6032发酵培养基及发酵工艺进行了优化，得到优化摇瓶发酵培养基为葡萄糖50 g/L，麦芽糖10 g/L，棉籽粉20 g/L，硫酸铵1 g/L，硫酸锌0.2 g/L，玉米浆15 g/L，牛肉膏2 g/L，碳酸钙5 g/L；确定摇瓶培养工艺为最佳接种量10%，最佳装液30mL/250mL摇瓶，最佳初始pH值为7.5。在优化培养条件下进行发酵培养，多杀菌素最终质量浓度达117.83 mg/L，较优化前发酵培养条件下所得质量浓度(89.57 mg/L)提高了31.6%。毒性实验表明发酵液对斜纹夜蛾幼虫毒杀效果显著，100 mg/L多杀菌素的发酵液作用于斜纹夜蛾48 h的致死率为90%。关键词：多杀菌素；发酵工艺；毒性20世纪80年代科学家从刺糖多孢菌(Saccharo-polysporaspinosa )代谢产物中分离出具有杀虫活性的物质，即多杀菌素，又名刺糖菌素。在全球范围内广泛开展的各项实验表明多杀菌素对鳞翅目(菜青虫、小菜蛾、棉铃虫、斜纹夜蛾、甜菜夜蛾、烟芽夜蛾、谷实夜蛾、苹果卷叶蛾、桃潜叶蛾、菜螟、黏虫等)、缨翅目害虫(棕榈蓟马、温室蓟马、花蓟马、稻蓟马等)有较高的杀虫活性。对鳞翅目昆虫而言，多杀菌素是目前已发现的杀虫剂中选择性最高的化合物之一。多杀菌素曾因其低毒、低残留、对昆虫天敌安全、自然分解快等特性而获得美国“总统绿色化学品挑战奖”[1]。1997年多杀菌素产品被批准投放美国市场。美国陶氏农业科学公司生产的2.5%悬浮剂和48%悬浮剂已获得我国农药的临时登记，分别用于防治甘蓝小菜蛾和棉花棉铃虫。而我国关于多杀菌素的研究还处于实验室阶段，因此，加快利用微生物发酵生产多杀菌素的研究迫在眉睫。陈继红等[2]对多杀菌素的航天育种进行了研究，多杀菌素的产量提高了288%；代鹏等[3]通过紫外线、氮离子注入等方法进行育种，多杀菌素产量提高了171%；车可舒等[4]通过传统育种方法使多杀菌素产量提高了35%。本研究对筛选得到的多杀菌素多孢菌的发酵工艺及毒性进行了研究。1 材料与方法1.1 菌种和培养基1.1.1 菌种刺糖多孢菌S-6032，本实验室选育保藏。1.1.2 培养基种子培养基：葡萄糖10 g/L，酪蛋白胨2 g/L，酵母粉1 g/L，牛肉浸膏1 g/L，灭菌前pH值7.3。优化前发酵培养基：葡萄糖60 g/L，棉籽粉25 g/L，玉米浆15 g/L，牛肉浸膏2g/L，碳酸钙5 g/L(调pH值后添加)，灭菌前pH值7.3。121 ℃条件下灭菌25 min。1.2 实验方法1.2.1 菌种培养种子液培养条件：250 mL摇瓶装30 mL培养基，由斜面菌落或冷冻保藏菌接种，摇床转速200 r/min，28 ℃振荡培养3 d。发酵培养条件：250 mL摇瓶装30 mL培养基，接种量为10%，摇床转速200 r/min，28 ℃振荡培养7 d。1.2.2 刺糖多孢菌生长曲线考虑到发酵培养基组分中棉籽粉和碳酸钙均不溶于水，影响菌体生物量的测定，故采用以下培养基组成：葡萄糖30 g/L，酪蛋白胨6 g/L，酵母粉3 g/L，牛肉膏3 g/L，灭菌前pH值7.3。250 mL摇瓶装30 mL培养基，接种量10%，摇床转速200 r/min，28 ℃振荡培养204 h。菌体生物量测定：取10 mL发酵液，5 000 r/min离心10 min，倒掉上清液，用蒸馏水洗涤菌体，5 000 r/min离心10 min，倒掉上清液，用蒸馏水将菌体移入预先干燥至恒重m0的称量瓶中，置于105 ℃电热恒温干燥箱中干燥至恒重，用精密电子天平称量瓶和菌体总质量m，则菌体生物量(细胞干重W)可用下式计算：W(g/L)＝1 000×(m-m0)/10还原糖的测定方法：采用菲林试剂快速滴定法测定培养液残糖质量浓度[5]。1.2.3 培养基优化在单因素实验的基础上，借助软件正交设计助手(Orthogonality Experiment Assistant，v3.1)采用L18(37)标准正交设计对优选出的单因子组合进行优化的正交实验(见表1)。表1 正交实验因子与水平设定(g/L)因子 葡萄糖 麦芽糖 棉籽蛋白 硫酸铵 硫酸锌 玉米浆 牛肉膏水平1 40 10 20 1 0.2 10 1水平2 50 20 25 2 0.5 15 2水平3 60 30 30 3 1.0 20 31.2.4 接种量优化以接种量10%作为对照，分别采用5%、10%、15%的接种量进行发酵实验，测定多杀菌素产量，分析比较后确定最适接种量。1.2.5 装液量优化以250 mL药瓶装液30 mL作为对照，分别采用20、30、40、50 mL的装液量进行发酵实验，测定多杀菌素产量，分析比较后确定最适装液量。1.2.6 培养基初始