生物学生试验手册.PDF

實驗手冊 SDS（SDS-Polyacrylamide Gel Electrophoresis ）蛋白質電泳 一、 SDS藥品及試劑 1. A 液: 丙烯醯胺液（total 30% ，cross-linking 2.6% ，可表示為30%T ，2.6%C ）：29.2 g acrylamide + 0.8 g Bis ，加水至100 ml （※acrylamide 具神經毒！不可直接接觸，膠 體凝固後毒性會消失 ） 2. B液: 分離膠體緩衝液（running或 separation buffer ）：90.8 g Tris base + 108 ml TEMED ，加水300 ml ，以1 M HCl調 pH 8.8 ，再加水至500 ml 。（註：TEMED可幫 助自由基的傳導，是一種催化劑） 3. C液: 焦集電泳緩衝液（stacking buffer ）6 g Tris base + 0.4 ml TEMED ，加水40 ml ， 亦以1 M HCl調 pH 6.8 ，再加水至100 ml 。 4. D液：5 X電泳緩衝液（ chamber buffer ）30.3 g Tris base + 142.6 g glycine （甘氨酸）， 加水 800 ml ，pH調 至8.3 ，再加水至1 L ，使用時稀釋5倍。註：[ glycine是電極緩 衝液的主要因子，是造成電泳樣本焦集的原因，也可改用 boric acid （如下面F液）] 5. E 液: 2 X樣品溶液: 3 g Tris base + 14.8 mg EDTA + 4 g SDS + 10 ml 2-mercaptoethanol ，加水80 ml ，pH調至 6.8 ，再加水至100 ml 。 6. F液: 5 x通用電泳緩衝液: 54.5 g Tris base + 24.8 g boric acid + 4.7 g EDTA ，加水800 ml ，pH調至 8.4 ，再加水至1 L 。 7. 10% SDS ：※注意，SDS 粉末很輕，飛揚起來很容易吸入肺部，在肺泡溶解產生界 面活性的作用，使得肺部細胞無法進行氧分子交換，秤取時務必戴口罩 8. 5%過硫酸銨（APS ，ammonium persulfate ）:自由基的產生者，可誘發 acrylamide的 連鎖聚合反應，是整個凝膠反應的起始者，最好使用前才配製，冬天可增至 10% ， 夏天可減至 2% ，注意APS固體很容易分解，應密蓋存於乾燥皿，一般鑄膠無法凝 固的原因多出自於此。 9. 追蹤染劑（tracking dye ）：1 mg bromophenol blue 加 5 ml水，再加 5 ml甘油，混合 均勻。 10.固定液（ fixing solution ）：50﹪甲醇， 10﹪醋酸：在 1 L量筒中，置入 500 ml methanol + 100 ml acetic acid ，再加水至1 L ，混合均勻密蓋。 11. 染色液（CBR ）：1.5 g Coomassie brilliant blue R-250 加水 250 ml ，再加250 ml甲醇 及 50 ml醋酸，混合均勻，若有不溶物質則需過濾。 12. 脫色液： 10%甲醇，7%醋酸：在 1 L量筒中，置入 100ml methanol + 70 ml acetic acid ， 再加水至 1 L ，混合均勻密蓋。甲醇濃度提高，可增加脫色速度，但小心脫色過度。 13. 蛋白質標準分子量：一般常用的有 Myosin (250 KDa), phosphorylase (94 KDa), albumin (67 KDa), glutamic dehydrogenase (64 KDa), alcohol dehydrogenase (50 KDa), ovalbumin (43 KDa), carbonic anhydroase (36 KDa), myoglobin (30 KDa), trypsin inhibitor (20 KDa), lysozyme