2006年上海监测点婴幼儿腹泻标本中诺如病毒基因研究.docVIP

2006年上海监测点婴幼儿腹泻标本中诺如病毒基因研究诺如病毒（Norovirus，NV）属于杯状病毒科（Human caliciviruses，HuCV），是引起病毒性腹泻最常见的病原体之一。临床主要表现为恶心、呕吐、腹痛和腹泻。常年都有诺如病毒感染病例发生，发病高峰为秋冬季。各年龄段的人群都普遍易感。传播途径以粪－口感染为主，绝大部分病毒性腹泻局部爆发是食入被NV污染的食品或水源造成的。近5年里，发生过诺如病毒性腹泻爆发地区极为广泛，遍布美洲、欧洲、澳洲、亚洲等地 ［1-7]。2006年底，日本大规模的诺如病毒爆发，引起世界强烈反响。我国也有诺如病毒性腹泻小规模爆发报道，北京、广东、山东、湖南、河北等地都曾有发生。就此，研究者对2006年2月―12月收集的监测点婴幼儿病毒性腹泻标本进行诺如病毒的核酸检测和序列测定，并和世界常见的GII1~GII8基因型诺如病毒参考株核酸序列以及世界各国2003―2006年公布的诺如病毒核酸序列进行比对，以了解本地区诺如病毒基因型别，分析其核酸变异情况。?? 1材料和方法? 1.1阳性对照毒株? 阳性对照毒株为中国疾病预防控制中心（中国CDC）腹泻室提供的含诺如GII型基因组病毒的大便悬液（阳性对照）。? 1.2标本来源? 89份标本来自于上海市松江区疾病预防控制中心（松江区CDC）2006年2月―12月送检的5岁以下，发病3日内，经临床实验室诊断为疑似病毒性腹泻标本。? 1.3引物? 引物采用杯状病毒289/290引物对［5］，由上海基康生物技术有限公司合成。? 1.4病毒RNA提取? 将腹泻标本制成20％粪悬液，以10 000 ?r/min离心10min，取上清140μL用于RNA提取。提取步骤参照试剂盒（QIAamp mini viral RNA kit，Qiagen公司）说明书，最后用60μL洗脱液洗脱RNA作为RT-PCR扩增模板。? 1.5核酸扩增? 使用PCR扩增仪（PE 9700，美国ABI公司）完成核酸扩增。反应试剂（Promega公司）：10×buffer 5μL，MgCl2（25mmol/L）4μL，dNTPs（2.5mmol/L）5μL，引物对289/290（20μmol/L）各0.5μL，AMV逆转录酶（10U/μL）和TaqDNA聚合酶(5U/μL)各0.5μL，反应模板5μL，用无酶水补足反应总量至50μL。反应程序：42℃,30min逆转录，94℃预变性5min，随后进行35个循环的94℃ 45s变性；56℃ 45s复性；72℃ 1min延伸，最后72℃延长延伸时间至10min。取8μL扩增产物和2μL上样缓冲液混匀后在1.5％的琼脂糖凝胶上以100V恒压状态下电泳30min左右，通过凝胶成像仪（GIS2010，中国天能公司）观察319bp的特异性扩增条带。? 1.6测序? 送上海基康生物技术有限公司进行测序。? 1.7诺如病毒核酸序列收集? 收集世界公认的诺如病毒参考株序列，序列号分别为DQ078197、AF414424、AF080549、AF145896、X86557、AY587985、AB240190、AB240172、HCU07611、AY134748、HCU22498、AF414423、AF414409、AF414407、AB039780。同时收集2003―2006年?NCBI/Genbank数据库中公布的诺如病毒RNA依赖的多聚酶（RdRp）核酸序列，序列号分别为AY900231、DQ288303、DQ078801、DQ440547、DQ288305、AB220924、EF126961、EF126962、AB240184、AB240188、DQ026456、AY 588028、EF126965、DQ157115、AY766290、EF121840、AY678468、EF126966、AJ626596、AY766273、DQ173774、DQ138990、AB291542、EF200697。? 1.8核酸序列分析? 运用DNAStar生物基因分析软件包完成相关序列的同源性分析和基因遗传进化树绘制。?? 2结果? 2.1核酸扩增? 经一步法RT-PCR检测，送检的89份标本中有15份在319bp处出现诺如病毒特异性扩增条带（见图1）。?? 注：“1-2”为诺如病毒阳性标本核酸扩增产物，“3”为阳性对照标本核酸扩增产物，“4”为阴性对照标本核酸 2.2测序和比对? 将15份RT-PCR扩增产物（编号为n1～15）送上海基康生物技术有限公司测序，获得测序结果12份。3份扩增条带由于浓度低，未完成测序。将12份测序结果递