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大蒜素协同草酸铂对直肠癌细胞凋亡作用影响【摘要】 目的 探讨大蒜素对人直肠癌SW480细胞周期的影响及其与特异性抗癌药物草酸铂联合使用的抗肿瘤作用。方法 MTT法检测大蒜素对直肠癌细胞的增殖抑制作用；流式细胞仪检测细胞周期改变；Annexin V-FITC标记法定量检测细胞凋亡；观察大蒜素与草酸铂联合使用后药物对细胞毒活性的改变。结果 大蒜素可明显抑制SW480细胞生长，大蒜素作用SW480细胞24 h后，与对照组比较，G0/G1期细胞的百分率明显减少，而G2/M期明显增加（P0．05），大蒜素与草酸铂联合使用后，草酸铂72 h IC50值由单独应用的9．21 μg/ml下降至1．07 μg/ml；细胞凋亡率由65．3%增至97%。结论 大蒜素可将直肠癌SW480细胞阻滞于G2/M 期，大蒜素与草酸铂联合使用可能具有协同抗肿瘤作用。 【关键词】大蒜素；直肠癌SW480细胞；细胞周期；草酸铂 1 材料与方法 1．1 材料 直肠癌细胞系SW480细胞、Annexin V 细胞凋亡试剂盒由上海莱鑫仪器有限公司提供。 RPMI1640培养基和胰酶购自Gibco公司，小牛血清购自杭州四季青公司，噻唑蓝(MTT)、DMSO购自Amresco公司，96孔板购自Costar公司，碘化丙啶(PI)、RNase为Fluka公司产品。 FACScan(B.DUSA)流式细胞仪;Bio-RAD Mod-el550(B.DUSA)酶标仪。 1．2 细胞培养 将SW480细胞接种在100 ml培养瓶中，用含15%小牛血清的RPMI1640培养液， 于37℃、5%CO2的培养箱中培养，细胞贴壁80%时传代，1周传2~3次。实验用细胞为接种24 h后的对数生长期细胞。 1．3 MTT法检测大蒜素和草酸铂对直肠癌细胞SW480的抑制作用 消化收集对数生长期细胞并调整成浓度为5×104 ml的单细胞悬液，接种于96孔培养板中，24 h后加入以RPMI1640培养液配制的大蒜素，终浓度分别为80、40、20、10和5 μg/ml，同时设立含RPMI1640全培养基的空白对照组。同法配制草酸铂，终浓度分别为40、20、10、5和2．5 μg/ml。每一浓度设5个复孔，分别继续培养24、48和72 h；弃上清液后每孔加MTT 50 μl，浓度为1 mg/ml，混匀，于37℃、5%CO2 的培养箱中孵育4 h；弃上清液后每孔加150 μl的DM-SO溶解蓝紫色颗粒，以酶标仪检测波长490 nm的每孔吸光度值(A值)。实验重复2次，计算细胞抑制率。 细胞增殖抑制率=(1-实验组光密度值/对照组光密度值)×100%。采用LOGIT药物浓度抑制统计分析软件计算IC50值。 1．4 细胞周期分析 用流式细胞仪检测，取生长状态良好的细胞接种在大方瓶中，培养至密度达60%~70%时分别加入不同浓度大蒜素，设立正常对照组，培养72 h收集细胞。收集的细胞以PBS洗3次，以4℃70%乙醇固定液，1 000 r/min离心5 min，弃去乙醇，PBS洗3次后，加入10 μg/ml的RNase于37℃消化0．5 h，加入50 μg/ml的PI于4℃染色0．5 h，流式细胞仪进行DNA含量和细胞周期分析，所用软件为Cellqest。 1．5 细胞凋亡检测 以Annexin V-FITC标记法定量检测草酸铂和大蒜素联合应用时细胞凋亡的变化。将终浓度为IC50值的大蒜素和草酸铂分别加入直肠癌细胞SW480，培养72 h；另一组细胞先经浓度为1/2IC50 值的大蒜素诱导24 h后再加浓度为IC50值的草酸铂作用72 h，并设立正常对照组。细胞用0．25%胰蛋白酶消化收集，PBS清洗2次，于4℃ 2 000 r/min离心5 min，收集(1~5)×105细胞，吸取250 μl的Binding Buffer和250 μl的灭菌去离子水，混匀；用上述500 μl的Binding Buffer悬浮细胞，加1 μl Annexin V-FITC，室温下混合，加入5 μl浓度为20 mg/L的PI，避光室温反应5 min，用流式细胞仪分析(绿色荧光用FL2来检测，红色荧光用FL1来检测)。 1．6 两药联合应用72 h时草酸铂IC50值的变化 依据1．3所测的大蒜素和草酸铂抑制直肠癌SW480细胞72 h的IC50 值，一组应用终浓度为IC50值大蒜素诱导培养细胞24 h后，草酸铂再作用于SW480细胞72 h检测草酸铂IC50值的变化；另一组将IC50浓度大蒜素与草酸铂同时作用于SW480细胞检测草酸铂72 hIC50值的变化。 1．7 统计学处理 数据采用（x±s）表示，两组间均数比较采用t检验，多组均数比较采用