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人离体子宫在位内膜细胞原代培养方法探析(1．广州中医药大学第一附属医院，广东广州 510405；2．广东省计划生育研究所，广东广州510600) 摘要：目的：比较不同的消化酶对人离体子宫内膜腺上皮细胞和间质细胞分离培养的异同，为研究人体子宫内膜细胞生长、分化及药物作用机制提供一个较理想的实验方法。方法：将人离体子宫内膜细胞随机分为胰酶组、胶原酶组、胰酶组和胶原酶联合消化组进行消化分离和体外培养，用倒置相差显微镜观察细胞的生长状况及形态特点。结果：3组的培养成功率分别为53.33％、73.33％、86.67％。联合消化组较胰酶组培养成功高(P＜0.05)。3种不同方法消化分离后的子宫内膜腺上皮细胞及间质细胞贴壁、生长状况无明显差异(P＞0.05)。结论：采用胰酶与胶原酶联合消化法进行子宫内膜细胞消化分离和体外培养，较单用胰酶法细胞培养的成功率高，比单用胶原酶缩短了消化时间，具有降低培养成本的优点。 关键词：子宫内膜；腺上皮细胞；间质细胞；细胞离体培养 中图分类号：R329.2 人子宫内膜由腺上皮细胞、间质细胞和血管组成，是卵巢激素作用的靶组织，在生殖生理的研究中占有重要的地位。现代妇产科学向细胞、亚细胞及分子水平发展，子宫内膜细胞体外培养为研究细胞生长、分化和代谢以及激素作用机制提供一个理想的实验模型Ⅲ，并且可以避开用人体实验进行研究所带来的伦理学问题。而原代培养细胞由于刚离开机体，因此能较好地反映体内细胞的生物学特性，故人离体子宫在位内膜原代培养已成为体外研究的一个重要方法。我们参考文献报道的两种消化酶，即胰酶和胶原酶，并将二者联合应用于分离消化法，对子宫内膜细胞进行了体外培养方法比较，以期得到更为理想的子宫内膜的培养方法。 1．资料与方法 1．1纳入标准 月经干净后3～7d；月经周期规则；年龄20～45岁；术前3个月内未用过激素治疗；无宫内节育器；无内科合并症。 1．2标本采集 人体正常离体子宫内膜取自2007年2～5月在本院行妇科手术患者，45例标本均在无菌条件下获得。 所获标本立即置入4℃、不含钙、镁的无菌Hank’s平衡液(DHBSS)中，30min内低温转移至实验室进行培养。全部标本均留部分组织用10％福尔马林液固定后作组织学检查。组织学检查未发现病理学改变，其组织学分期均为增生期。将所取标本随机分为3组，每组为15例，分别采用胰酶、胶原酶、胰酶和胶原酶联合消化的方法进行体外培养。3组患者年龄无明显差异(p=0.88＞0.05)。 1．3材料与仪器 1．3．1生长培养液由DMEM／F12培养基+15％标准胎牛血清+100U/ml青霉素链霉素液配制而成。DMEM/F12培养基、标准胎牛血清、青链霉素液、DHBSS购自广州威佳公司，为GIBCO公司干粉配制。 1．3．2细胞消化液胰酶、胶原酶I购自广州威佳科技公司。取胰酶0.25g用灭菌去离子水100m1溶解，配制成终浓度为0.25％的消化液，过滤分装，-20℃保存；取胶原酶I100mg加入灭菌去离子水100ml充分溶解，配制成终浓度为0.1％的消化液，过滤分装，-20℃保存。 1．3．3仪器CO2恒温细胞培养箱，25cm2底面积的培养瓶，倒置相差显微镜，台式离心机，微量可调移液器等。 1．4原代培养方法 参照Ryan、Overton等的方法并作改进： 1．4．1胰蛋自酶消化法将所获组织用DHBSS溶液洗涤3次，剪成约0.5～1.0mm3大小的碎块，置入无菌青霉素小瓶中，注入预加温至37％的0.25％胰蛋白酶消化液约4～5m1，混匀后置37％温箱中消化。每5～10分钟用玻璃吸管轻轻吹打细胞，15min后静置片刻，待组织下沉后，吸出2/3上清液转移至10m1玻璃离心管中，加入含有20％胎牛血清的培养液终止消化。剩余1/3，再补加新的胰蛋白酶液继续消化。消化时间为20～30min，消化后细胞悬液含单个间质细胞及葡萄串状上皮细胞。消化完毕后1000r/min，离心5min，吸除上清液。将沉淀物用DHBSS漂洗2遍后，加入培养液，吹打成均匀的细胞悬液。调整细胞密度为1×103/ml，接种于25Cm2的培养瓶中。置于37℃、5％CO2的温箱中培养。以后每隔3d更换培养液1次，换液时注意留1/4原培养液，至单层细胞融合而完成细胞培养。期间，每天用倒置显微镜观察细胞的形态和生长状况，并做好记录。 1．4．2胶原酶消化法方法基本同1．4．1，仅是消化时间较为宽松，为50～70min，其间可不用换液。用此种方法培养时，不用含血清的培养液终止消化，因血清仅可抑制胰酶的作用，对胶原酶无影响。经过胶原酶消化后的上皮组织，由于上皮细胞对酶有耐受性，可能会有一些上皮细胞团尚未被完全消化开。成小