提取法用于伊曲康唑胶囊微生物限度方法检查.docVIP

提取法用于伊曲康唑胶囊微生物限度方法检查【摘要】目的：探讨伊曲康唑胶囊微生物限度方法学验证。方法：采用十四烷酸异丙脂提取法，将有抑菌成分的物质转移至油相，水相用于试验。结果：白色念珠菌、黑曲霉菌的回收率达到70％以上。结论：提取法可以用于伊曲康唑胶囊微生物限度方法检查，简单易行。 【关键词】提取法；伊曲康唑胶囊 文章编号：1009-5519（2007）03-0343-02 中图分类号：R9 文献标识码：A 伊曲康唑胶囊是抗真菌的药物，在水中不溶，其内容物为包衣颗粒，进行微生物限度方法学验证时发现真菌的回收率不到70％，选用离心薄膜过滤法无法滤过，我们利用油水相分层原理选用适宜的提取液提取供试品的稀释液，将水相用于试验。 1仪器与材料 1.1玻璃器皿：培养皿，量筒，输液瓶（100 ml,250 ml），一次性注射器。 1.2试剂：十四烷酸异丙脂（国产和进口）。培养基：营养肉汤、营养琼脂培养基、玫瑰红钠琼脂培养基、pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液。对照菌：枯草杆菌CMCC（B）63501 第三代；金黄色葡萄球菌CMCC（B）26003第三代；大肠埃希菌CMCC（B）44102第三代；白色念珠菌CMCC (F) 98001第三代； 黑曲霉菌CMCC(F)98003第三代。供试品：伊曲康唑胶囊（批产厂家；成都倍特药业有限公司）。 2试验方法 2.1常规法 2.1.1菌液制备：（1）取经35℃培养24小时，金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草杆菌的肉汤培养物1 ml加9 ml无菌生理盐水，10倍稀释至10-5～10-7，细菌数约为50～100 cfu/ml，做活菌计数备用。（2）取经25 ℃培养24小时的白色念珠菌霉菌液体培养物1 ml加9 ml无菌生理盐水，10倍稀释至10-5～10-7，细菌数约为50～100 cfu/ml，做活菌计数备用。（3）取经25℃培养1周的黑曲霉菌斜面培养物，加5ml盐水洗下霉菌孢子，吸取出菌液，然后取1 ml加9 ml无菌生理盐水，逐管10倍稀释为10-4，细菌数约为50～100 cfu/ml，做活菌计数备用。 2.1.2供试液的制备：取伊曲康唑10 g，加pH值为7.0的无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液200 ml，45℃ 保温，使胶囊溶解，使分散均匀，制得1∶20供试液，分别人工污染上述5种代表试验菌株。再加15～20 ml琼脂培养基，待凝固后，置规定温度培养24～72小时观察结果细菌与霉菌计数，测定回收率。 2.1.3该供试品对大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草杆菌的回收率试验均高于70%，可采用常规方法检验。对白色念珠菌、黑曲霉菌有很强的抗菌活性，供试品回收率为0%，均低于70%。 2.2采用十四烷酸异丙脂提取将有抑菌成分的物质转移至油相、水相用于试验。 2.2.1提取液的筛选试验：取本品10 g，加45℃ pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液200 ml，使分散均匀，取该1∶20供试液上清液10 ml置于100 ml输液瓶中，分别加无菌十四烷酸异丙脂20 ml、30 ml、40 ml、50 ml，充分振摇，将输液瓶倒置，静置使油水明显分层，分别取其水层1 ml加入平皿，分别人工污染白色念珠菌、黑曲霉菌2种试验菌株，再加15～20 ml琼脂培养基，待凝固后，置规定温度培养72小时观察结果细菌与霉菌计数，测定回收率。结果见表1。 2.2.2稀释液回收率试验：十四烷酸异丙脂50 ml中加入稀释液（pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液）10 ml共5瓶，分别人工污染枯草杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、白色念珠菌、黑曲霉菌5种试验菌株，振摇5分钟，倒置分层，分别取其水层1 ml加入平皿。再加15～20 ml琼脂培养基，待凝固后，置规定温度培养48～72小时观察结果细菌与霉菌计数，测定回收率。结果见表2。 另取十四烷酸异丙脂油层平皿计数，均无菌生长。表1结果证明，采用提取法加入提取液50ml时可消除供试品对人工污染白色念珠菌和黑曲霉菌的抑菌作用，回收率达到70%以上。表2结果说明，细菌和真菌基本上存在水相，稀释液回收率80％以上。因此，提取法可用于伊曲康唑胶囊的霉菌检查。 3讨论 3.1供试品为胶囊剂，需45℃水浴保温使囊壳溶解；其内容物为包衣颗粒，需用匀浆仪或研细方法让供试品分散均匀；1∶10的浓度比较黏稠，虽然伊曲康唑对细菌没有抑菌作用，也将细菌和大肠埃希菌检查都采用1∶20。 3.2霉菌检查时不能将十四烷酸异丙脂直接加入供试品中；十四烷酸异丙脂用量太大，成本太高。吸取上清液10 ml时应注意不要吸入颗粒，否则会堵塞注射器针头；分层后用注射器缓慢吸取下层水相，注意不要吸取到十