电针对动情周期不同阶段大鼠GnRH免疫反应表达探究.doc

电针对动情周期不同阶段大鼠GnRH免疫反应表达探究[摘要]目的：探讨电针对下丘脑一垂体一靶腺轴特异性调节规律。方法：成熟雌性SD大鼠按动情周期的4个阶段随机分为假电针组、“关元”组、“内关”组。针刺治疗在早晨9:30开始持续30min，下午15:00时断头取脑组织。通过免疫组织化学染色观察促性腺激素释放激素(GnRH)免疫反应在下丘脑与生殖内分泌相关核团的表达。结果：①动情周期不同阶段GnRH免疫反应表达的数量不同，动情前期和动情期较多；②针刺后在内侧视前区、弓状核、室旁核等部位动情周期的不同阶段GnRH免疫反应的表达均有不同程度的增加，尤其是“关元”组在动情间期和动情后期GnRH“强”免疫反应表达增加明显。结论：电针后下丘脑GnRH免疫反应表达明显增加的部位有内侧视前区、弓状核、室旁核等，“关元”组优于“内关”组，动情间期及动情后期表现明显。 [主题词]电针；动情周期；基因表达；促性腺素释放激素／代谢；下丘脑／代谢 临床广泛运用针刺治疗妇科内分泌失调性疾病[1,2]，如对更年期综合征、更年期提前、不孕症、性早熟等疾病的治疗都有独特疗效。但由于性激素分泌的周期性特点，再加上穴位有广泛性效应存在，使临床针灸治疗方案出现混乱无序的状态，虽然所选穴位对生殖内分泌功能都有调节作用，但要判断其特异性和规律性是不可能的。 大鼠和人一样具有动情周期，每个周期4～5昼夜分4个阶段：动情间期、动情前期、动情期、动情后期。在动情周期的不同阶段卵巢、子宫及动物性行为的变化直接受性激素的调控，其中下丘脑中的促性腺激素释放激素(Gonadotropin releasing hor-mone，GnRH)神经元是控制性激素分泌的直接指导者[3]。许多研究人员从不同的角度研究了下丘脑中与生殖内分泌功能相关的神经元在动情周期中的活性和反应性，发现在动情期因GnRH分泌量多，GnRH相关肽(GAP)和其前体物质在神经元和神经末梢内的含量明显减低，而在动情间期GnRH相关肽及其前体物质则含量多，为下一个动情期的GnRH大量分泌提供了物质基础[4]。GnRH分泌的增加是青春期和动情期的始动因素[5]，如将下丘脑中视交叉上核和内侧视前区间断性损坏，影响雌鼠GnRH神经元的分泌，则可中断动情周期以及黄体生成素(LH)排卵前的大量释放[6]。 本实验通过观察雌性成年大鼠动情周期的不同阶段在下丘脑与生殖内分泌相关核团GnRH免疫反应的表达，研究针刺相同穴位在动情周期的不同阶段及不同穴位在动情周期的相同阶段对GnRH分泌的特异性调节规律，为揭示针刺对下丘脑一垂体一性腺轴的调节机理打下基础。 1　材料与方法 1.1动物的选择及分组 雌性生殖龄Sprague-Dawley大鼠，体重240～ 280g，由中国科学院遗传与发育生物学研究所(SC―SK-2002－0016)提供，为普通级动物。标准啮齿类动物饲料分笼喂养，室温：(20±2)℃，光照12h。实验所用GnRH兔抗鼠多克隆抗体(#ABl567，Chemi－con，美国)，采用MIS 2000 imagine pro-4.1(美国)图像处理及分析系统测定GnRH免疫反应的表达。 实验前2周每天上午8:00进行阴道细胞学检查，依照施新酞[7]方法确定动情周期的不同阶段，连续观察2个动情周期，选用有正常动情周期的大鼠作为研究对象。 大鼠随机分为3个组：“关元”穴组(24只)、“内关”穴组(24只)和假电针组(24只)。每组的24只动物再分为动情问期(6只)、动情前期(6只)、动情期(6只)、动情后期(6只)。 每日晨8:00时取阴道涂片，以确定动情周期的不同阶段。针刺治疗时动物采用10％氨基甲酸乙酯(1.0～1.2g/kg)腹腔注射麻醉。针刺自早晨9:30时开始，行电针治疗30min后出针。下午15:00时断头取脑组织。 1.2针刺方法及电刺激条件 针刺方法：针刺“关元”穴组将一根针刺在“关元”穴接正级，另一根针刺在“关元”穴的相同经脉线上间隔5mm处接负极。用高性能针灸治疗仪(ZYZ-20GYl)给予电针刺激。 针刺“内关”穴组电针方法同“关元”穴组。 假电针取穴同“内关”穴，只是不加电流。 电针参数为：强度2～5mA，频率20～60Hz，疏密波。针刺“关元”穴时刺激量以阴道口有规律性的收缩为准，针刺“内关”穴时刺激量以前肢有规律性的收缩为度。 1.3 GnRH免疫组化染色(ABC法) 于当日15:00时将动物断头取脑组织，用干冰速冻后在一70|C条件下保存。自下丘脑水平制成16μm厚的连续冠状冰冻切片，每隔4张取1片，用于GnRH免疫组化染色，兔抗鼠多克隆抗体(#ABl567，Chemicon，美