甘露聚糖酶活力测定.docVIP

甘露聚糖酶活力的测定 1.甘露聚糖酶活力单位定义 在37℃、pH值为5.5的条件下，每分钟从浓度为3mg/ml的甘露聚糖（Sigma G0753）溶液中降解释放1umol还原糖所需要的酶量为一个酶活力单位u。 2.测定原理 甘露聚糖酶能将甘露聚糖降解成寡糖和单糖。具有还原性末端的寡糖和有还原基团的单糖在沸水浴条件下可以与DNS试剂发生显色反应。反应液颜色的强度与酶解产生的还原糖量成正比，而还原糖的生成量又与反应液中甘露聚糖酶的活力成正比。因此，通过分光比色测定反应液颜色的强度，可以计算反应液中甘露聚糖酶的活力。 3.试剂与溶液 除特殊说明外，所用的试剂均为分析纯，水均为符合GB/T6682中规定的三级水。 3.1甘露糖溶液，c（C6H12O6）为10.0mg/ml： 称取无水D-甘露糖1.000g，加水溶解，定容至100ml。 3.2 乙酸溶液，c（CH3COOH）为0.1mol/L： 吸取冰乙酸0.60ml。加水溶解，定容至100ml。 3.3 乙酸钠溶液，c（CH3COONa）为0.1mol/L： 称取三水乙酸钠1.36g。加水溶解，定容至100ml。 3.4 氢氧化钠溶液，c（NaOH）为200g/L： 称取氫氧化鈉20.0g。加水溶解，定容至100ml。 3.5 乙酸——乙酸钠缓冲溶液，c（CH3COOH—CH3COONa）为0.1mol/L，pH值为5.5： 称取三水乙酸钠23.14g，加入冰乙酸1.70ml。再加水溶解，定容至2000ml。测定溶液的pH值。如果pH值偏离5.5，再用乙酸溶液（3.2）或乙酸钠溶液（3.3）调节至5.5。 3.6 甘露聚糖溶液：0.6%（w/v） 称取甘露聚糖（Sigma G0753）0.60g，加入80ml乙酸—乙酸钠缓冲溶液（3.5）。磁力搅拌，同时缓慢加热，直至甘露聚糖完全溶解（注：在搅拌加热的过程中可以补加适量的缓冲液，但是溶液的总体积不能超过100ml。）。然后停止加热，继续搅拌30min，用乙酸—乙酸钠缓冲溶液（3.5）定容至100ml。甘露聚糖溶液能立即使用，使用前适当摇匀。4℃避光保存，有效期为3天。 3.7 DNS试剂 称取3,5-二硝基水杨酸3.15g（化学纯），加水500ml，搅拌5s，水浴至45℃。然后逐步加入100ml氢氧化钠溶液（3.4），同时不断搅拌，直到溶液清澈透明（注意：在加入氢氧化钠过程中，溶液温度不要超过48℃。）。再逐步加入四水酒石酸钾钠91.0g、苯酚2.50g和无水亚硫酸钠2.50g。继续45℃水浴加热，同时补加水300ml，不断搅拌，直到加入的物质完全溶解。停止加热，冷却至室温后，用水定容至1000ml。用烧结玻璃过滤器过滤。取滤液，储存在棕色瓶中，避光保存。室温下存放7天后可以使用，有效期为 4 仪器与设备 4.1 实验室用样品粉碎机或碾钵。 4.2 分样筛：孔径为0.25mm（60目）。 4.3 分析天平：感量0.001g。 4.4 pH计：精确至0.01。 4.5 磁力搅拌器：附加热功能。 4.6 电磁振荡器。 4.7 烧结玻璃过滤器：孔径为0.45mm。 4.8 离心机：2000g以上。 4.9 恒温水浴锅：温度控制范围在30—60℃之间，精度为0.1℃ 4.10 秒表：每小时误差不超过5s。 4.11 分光光度计：能检测350—800nm的吸光度范围。 4.12 移掖器；精度为1ml。 5 标准曲线的绘制 吸取缓冲液（3.5）4.0ml，加入DNS试剂（3.7）5.0ml，沸水浴加热5min。用自来水冷却至室温，用水定容至25.0ml，制成标准空白样。 分别吸取甘露糖溶液（3.1）1.00、2.00、3.00、4.00、5.00、6.00和7.00ml，分别用缓冲液（3.5）定容至100ml，配制成浓度为0.10—0.70mg/ml D-甘露糖标准溶液。 分别吸取上述浓度系列的甘露糖标准溶液各2.00ml（做二个平行），分别加入到刻度试管中，再分别加入2ml水和5mlDNS试剂（3.7）。电磁振荡3s，沸水浴加热5min。然后用自来水冷却到室温，再用水定容至25ml。以标准空白样为对照调零，在540nm处测定吸光度OD值。 以甘露糖浓度为Y轴、吸光度OD值为X轴，绘制标准曲线。每次新配制DNS试剂均需要重新绘制标准曲线。 6 试样溶液的制备 固体试样应粉碎或充分碾碎，然后过60目筛（孔径为0.25mm）。 称取试样两份，精确至0.001g。加入50ml乙酸—乙酸钠缓冲溶液（3.5）。磁力搅拌30min，再用缓冲溶液（3.5）定容至100ml，在4℃条件下避光保存24h。摇匀，取出30-50ml，2000g离心3min。吸取5.00ml上清液，再用缓冲溶液（3.5）做二次稀释（稀释后的待测酶液中甘露聚糖酶活力最好能控制在0.0