苏云金芽胞杆菌新型杀虫晶体蛋白基因的克隆和其功能研究.pdf

密级 学校代码 10542 苏云金芽胞杆菌新型杀虫晶体蛋白基因 的克隆及其功能研究 novel of andfunctional Cloning study insecticidal fromBacillus genes protein crystal 研究生姓名 壑堡 指导教师姓名、职称 型：重至割鏊撞 湖南师范大学学位评定委员会办公室 二零一三年六月 0IIIII IIIIIllIIIII IIIIIIl 摘 要 苏云金芽胞杆菌(Bacillus 能够产生杀虫晶体蛋白。目前，对于Bt杀虫晶体蛋白的研究主要集中在 它的杀虫机理及其与靶标昆虫的相互作用方面。随着Bt杀虫剂的长期使 用，昆虫对其产生的抗性受到人们的广泛关注与深入研究。在多种抗性管 理策略中，筛选新的Bt杀虫菌株并挖掘杀虫新基因以及通过基因工程技 术构建新型杀虫毒素，已经成为延缓害虫对Bt杀虫剂产生抗性的有效方 法。 利用本研究室建立的聚丙烯酰胺凝胶包埋联合质谱检测技术，分析了 对蚊虫具有高毒力的Bt杰加森亚种(Bt 晶体的原毒素组成。结果表明，该菌株产生的伴胞晶体含有8种原毒素 蛋白共表达时，Cry30Ca的表达量提高5．9倍且能形成大的包涵体，这一 和Cry60Ba在Bt无晶体菌株中单独表达和共表达时，都能大量表达并形 活性，而Cry30Ca对该蚊虫则没有毒杀活性。 来自Bt以色列亚种(Bt 1Aa毒素和Bt杰 subsp。israelensis)的Cryl 加森亚种的Cryl 1Aa 1Ba毒素对蚊虫具有很高的毒杀活性。为了研究Cryl 和CryllBa不同结构域的功能，并通过在这两个毒素之间进行结构域置 1Ba 换来构建新型杀虫蛋白，本研究利用定点突变技术在Cryl1Aa与Cryl 的Domain I和II编码序列的连接位置引入了ClaI酶切位点及DomainII 和Ⅲ编码序列的连接位置引入了AflII酶切位点，由此构建出6种杂合毒 表达时，除ABA和ABB外，其余4种杂合毒素均能获取预期表达。将 亲本毒素和杂合毒素对埃及伊蚊(Aedes aegypti)及致倦库蚊进行生测， 发现亲本毒素CryllBa对以上两种蚊虫均表现出很高的杀虫毒力， 1Aa与杂合毒素AAB对以上两种蚊虫均表现相似的中等毒力，而其 Cryl lBa的3个结构域共存对于 它杂合毒素均没有毒力。这一研究表明Cryl 1Ba的结构域 其毒力具有重要作用，而Cryl1Aa的结构域III可以被Cryl I