RNAi干扰技术概要.ppt

RNA Interference (RNAi) 定义： RNA干扰（RNA interference, RNAi）是指将外源双链RNA导入细胞后引起与其序列同源的特异基因mRNA降解导致基因表达抑制的现象，属于转录后基因沉默(post-transcriptional gene silencing, PTGS)的一种形式。 它是真核生物中存在的一种抗病毒入侵、抑制转座子活动、调控基因表达的监控机制，具有重大生物学意义 。 RNAi的发现 1995年，Guo S等试图阻断秀丽新小杆线虫（C. elegans）中的par-1基因的表达。 设计： 反义RNA特异性阻断par-1基因的表达； 正义RNA以期观察到基因表达的增强。 结果： 二者都同样地切断了par-1基因的表达途径。这与传统上对反义RNA技术的解释不相符合。 RNAi的提出 1998年2月，Fire A 和Mello C将体外转录得到的单链RNA纯化后注射线虫时发现，基因抑制效应变得十分微弱；而经过纯化的双链RNA却正好相反，能够高效特异阻断相应基因的表达。 他们证实，Guo S博士遇到的正义RNA抑制基因表达的现象，都是由于体外转录所得RNA中污染了微量双链RNA而引起。 该小组将这一现象称为RNA干扰（RNA interference, 简称RNAi） RNAi广泛存在于自然界 随后，RNAi现象被广泛地发现于真菌、拟南芥、水螅、涡虫、锥虫、斑马鱼等大多数真核生物钟。 这种存在揭示了RNAi很可能是出现于生命进化的早期阶段。 随着研究的不断深入，RNAi的机制正在被逐步阐明，而同时作为功能基因组研究领域中的有力工具，RNAi也越来越为人们所重视。 RNAi作用机制 RNA干扰包括起始阶段 和效应阶段(inititation and effector steps)。 在起始阶段，不同来源的 dsRNA通过各种转基因技 术转入植物或线虫细胞内， 与 Dicer酶 (dsRNA-specific endonucleaes, Dicer ) 的 C末端结构域结合产生 21-23nt siRNAs 片断 ( small interfering RNA, 即siRNA ) 。 每个片断的3‘端都有 2nt 核苷酸突出。 在效应阶段， Dicer酶通过 PAZ结构域 与含有 PAZ结构域的 Argonaute蛋白 互相作用， 核酸内外切酶、解旋酶与 Argonaute蛋白相连进而与siRNA一 起形成具有多个亚单元的核糖核苷酸 蛋白复合物 ( RNA-inducing silencing complex, RISC ) 。 RISC中的解旋酶应用 ATP解开 siRNA双链 ，使其反义链互补结 合到靶向mRNA上与之相匹配的 特异性序列， RISC中的核酸酶 降mRNA ， 降解的 mRNA随后迅 速地被细胞其他的RNA酶所降解。 从而使 目的基因沉默，产生 R N A i 现象。 如何进行RNAi实验？ RNAi的设计 RNAi目标序列的选取原则、阴性对照 siRNA的制备 化学合成 、体外转录、RNase III 消化长片断双链RNA、体内表达 、 siRNA表达载体、siRNA表达框架 RNAi转染 磷酸钙共沉淀、电穿孔法 、机械法 、DEAE-葡聚糖和polybrene 、 阳离子脂质体试剂 RNAi目标序列的选取原则 (1)从转录（mRNA）的AUG起始密码开始，寻找“AA”二连序列，并记下其3‘端的19个碱基序列，作为潜在的siRNA靶位点。 (2)将潜在的序列和相应的基因组数据库（人，或者小鼠，大鼠等等）进行比较，排除那些和其他编码序列/EST同源的序列。 (3)选出合适的目标序列进行合成。通常一个基因需要设计多个靶序列的siRNA，以找到最有效的siRNA序列。 阴性对照 一个完整的siRNA实验应该有阴性对照，作为阴性对照的siRNA应该和选中的siRNA序列有相同的组成，但是和mRNA没有明显的同源性。通常的做法是将选中的siRNA序列打乱，同样要检查结果以保证它和目的靶细胞中其他基因没有同源性。 siRNA的制备方法及特点 RNAi转染 将制备好的siRNA，siRNA表达载体或表达框架转导至真核细胞中的方法主要有以下五种： 磷酸钙共沉淀将氯化钙，RNA(或DNA)和磷酸缓冲液混合，沉淀形成包含DNA且极小的不溶的磷酸钙颗粒。磷酸钙-DNA复合物粘附到细胞膜并通过胞饮进入目的细胞的细胞质。沉淀物的大小和质量对于磷酸钙转染的成功至关重要。在实验中使用的每种试剂都必须小心校准，保证质量，因为甚至偏离最优条件十分之一个pH都会