DNA的酶切、连接、转化和重组子的筛选与鉴定.docx

第二次分子生物学实验报告 DNA的酶切、连接、转化和重组子的筛选与鉴定 实验目的 学习和掌握限制性内切酶的分类、特性与作用原理，掌握载体和外源目的DNA酶切的操作技术。 学习利用T4 DNA 连接酶把酶切后的载体片段和外源目的DNA 片段连接起来，构建体外重组DNA 分子的技术，了解并掌握几种常用的连接方法。 掌握利用CaCl2 制备感受态细胞的方法；学习和掌握热击法转化E. coli 的原理与方法。 学习并掌握使用红白菌落法筛选获得重组子以及α互补筛选法的原理及方法。 学习和掌握使用试剂盒抽提质粒的方法； 复习琼脂糖凝胶电泳的原理和方法； 通过对重组子进行重组质粒DNA 的抽提与酶切鉴定，进一步确定重组质粒中含有外源目的DNA 片段，并验证重组子是期望的重组子。 实验原理 1、限制性内切酶 限制性核酸内切酶是一类能够识别双链DNA 分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA 双链结构的酶，主要是从原核生物中分离纯化出来的。在限制性核酸内切限制酶的作用下，侵入细菌的“外源”DNA 分子便会被切割成不同大小的片段，而细菌自己固有的DNA 由于修饰酶(通常是一种甲基化酶)的保护作用，则可免受限制酶的降解。 目前已经鉴定出3 种不同类型的限制性核酸内切酶，即Ⅰ型酶、II 型酶和III 型酶。 Ⅰ型酶切割位点是随机的，至少距识别位点1000bp。Ⅲ型限制酶的切割位点距识别序列3端为24—26bp。Ⅱ型限制酶的切割位点一般在识别序列上或与之靠近，而且具有序列特异性，故在基因克隆中有特别广泛的用途。 Ⅱ型核酸内切限制酶具有3个基本的特性：①在DNA 分子双链的特异性识别序列部位切割DNA 分子，产生链的断裂；②2个单链断裂部位在DNA 分子上的分布通常不是彼此直接相对的；③断裂结果形成的DNA 片段往往具有互补的单链延伸末端。 限制性核酸内切酶对DNA 底物的酶切作用是否完全，直接关系到连接反应、重组体分子的筛选和鉴定等实验结果。核酸内切限制酶活性的充分发挥受到以下几个因素的影响： 1）DNA样品的纯度，可采取措施有纯化DNA、加大酶的用量、延长酶催化反应的保温时间，扩大反应体积； 2）DNA 的甲基化程度，基因工程中必须使用甲基化酶失活突变的菌株； 3）酶切消化反应的温度； 4）DNA 的分子结构； 5）限制性核酸内切酶的缓冲液。 限制核酸内切酶是分子克隆中最常用的工具酶，在DNA重组技术中限制性核酸内切酶主要用在一下几方面：①构建重组质粒；②构建基因文库；③DNA 分子的杂交；④制备DNA 放射性探针；⑤绘制DNA 分子的限制酶图谱⑥DNA 序列分析；⑦基因定位及DNA 同源性研究。 2、限制性内切酶的酶切反应 体外构建重组DNA 分子，首先要了解目的基因的酶切图谱，选用的限制性核酸内切酶都不能在目的基因内部有专一的识别位点，即当用一种或者两种限制性核酸内切酶切割外源供体DNA 时，能够得到完整的目的基因。其次，选择具有相应的单一酶切位点的质粒、噬菌体等载体分子作为克隆的载体。常用的酶切方法有双酶切法和单酶切法两种。 （1）双酶切法：如果只在要克隆的目的DNA 二端具有不同的限制性核酸内切酶的识别位点，而目的基因内部没有相应的识别序列，可用这二种限制性核酸内切酶酶切，则目的DNA可产生二种不同的黏性末端。选择同样具有这二种限制性核酸内切酶识别位点的合适载体，酶切后，同样产生二个不同的黏性末端，当构建重组分子时，目的DNA 可以一定的方向插入载体中，这样操作效率高，也利于重组子的筛选。 （2）单酶切法：:如果目的DNA 片段只能用一种限制性核酸内切酶切割，酶切后的片段两端产生相同的粘性末端或者平末端。选择具有同样限制性核酸内切酶识别位点的合适载体，在构建重组分子时，除了形成正常的重组子之外，还可能会出现目的DNA 片段以相反方向插入载体分子中，或者目的DNA 串联后再插入载体分子中，甚至出现载体分子自连，重新环化的现象，因此重组效率较低。如果没有很好的方法区分转化子中的重组子，筛选重组子会比用双酶切法构建重组DNA 分子的工作量大很多。 单酶切法和双酶切法各有优缺点，在实际操作时要根据具体情况来定。 3、DNA连接酶 DNA 连接酶能催化双链DNA 片段紧靠在一起的3羟基末端与5磷酸基团末端之间形成磷酸二酯键，使两末端连接。目前用于连接DNA 片段的DNA 连接酶有E. coli DNA 连接酶和T4 DNA 连接酶。E. coli DNA 连接酶只能催化双链DNA 片段互补黏性末端之间的连接，不能催化双链DNA 片段平末端之间的连接。T4DNA 连接酶既可用于双链DNA 片段互补黏性末端之间的连接，也能催化双链DNA 片段平末端之间的连接，但平末端之间连接的效率比较低。 DNA 连接酶同限制性核酸内切酶一样，都是在体外构建重组DNA