实验四质粒DNA的提取.docVIP

实验四 质粒DNA的提取、电泳检测和酶切 一、实验目的 学用碱法质粒DNA。 二、实验原理 质粒DNA碎质粒DNA。质粒DNA的提取常用碱裂解法、煮沸法、SDS法、Triton-溶菌酶法等，其中以碱裂解法最为常用。本方法有质粒DNA产量高、快速等优点。 其原理为：在碱性溶液中，双链DNA氢键断裂，DNA双螺旋结构遭破坏而发生变性，但由于质粒DNA分子量相对较小，且呈环状超螺旋结构，即使在高碱性pH条件下，两条互补链也不会充分分离，当加入中和缓冲液调时，DNA和或有缺口的质粒DNA变性后双链分离，难以复性而形成缠绕的结构，与蛋白质—SDS复合物结合在一起；当K+取代Na+时，生成不溶的PDS, 这些复合物从溶液中沉淀下来。 通过离心沉淀，细胞碎片、染色体DNA及大部分蛋白质可被除去，而质粒DNA及小分子量的RNA则留在上清液中。混杂的RNA可用RNA酶（RNAase）消除。再用酚/氯仿处理，可去除残留蛋白质。 三、实验材料 含有质粒pUC19的。 四、实验器具、药品试剂高压灭菌锅 超净工作台 恒温摇床取 台式离心机(冷冻或非冷冻式) 旋涡振荡器 培养用试管 量筒 冰盒 微量取液器 吸管头若干 LB培养基 氨苄青霉素(Amp,100 mg/ml) 20%SDS 4 M NaOH 3M NaAc (pH5.2) 异丙醇 TE缓冲液(pH8.0) RNAase A(10 mg/ml) 70%乙醇无水乙醇75％乙醇NEB 标准分子量片段(1kb DNA Ladder)，EcoR I 及Dra I（Dra II？）限制性核酸内切酶（TaKaRa），EcoRI酶解缓冲液(10×H buffer)溶液I－GET缓冲液： 50 mmol/L葡萄糖， 10 mmol/L EDTA， 25 mMTris-HCl pH8.0。 溶液II－0.2 mol/L NaOH, 1%SDS 溶液III (4℃预冷)－乙酸钾溶液(3M, pH=4.8)： 60 mL的5 mol/L KAc, 11.5 ml冰醋酸， 28.5 mL H2O TE缓冲液或双蒸水（+ 20 (g/ml RNase ）: 10 mmol/L，Tris-HCl, 1 mmol/L，EDTA ， pH8.0, 五、实验方法 ml含有50 ug /mL Amp的LB培养液加入已灭菌的试管中， 2 挑取数个单菌落（含有50ug/ml氨苄的LB平板，含pUC19质粒）的DH5a菌液，接入上述5 mL含有氨苄青霉素（50 (g/ml）培养基中，37℃摇床150rpm培养5小时，培养基明显浑浊。 3 取1.5 ml1.5 ml离心管中，1000 r/min离心min，去上清液加入10 (l溶液I，充分悬浮菌体5 min。 5 加入00 (l新配制的溶液II（变性液），加盖颠倒6-7次使之混匀; min。 6 加入 (l溶液III，加盖后颠倒6-7次加盖颠倒6-7次使之混匀，5 min。12000 r/min离心5 min，上清移入另一干净离心管， 12000 r/min离心 min，上清移入另一干净离心管，并加60%体积的异丙醇混匀，12000 r/min离心min，弃去上清液; 9 沉淀 ml 70-75％乙醇，10000 r/min离心5 min，弃去上清液。。小管倒置于吸水纸上，除尽乙醇，室温自然干燥; 10 其中一份加入20 (l含有20 (g/ml RNase的TE 缓冲液溶解提取物，加入20 (l TE 缓冲液溶解提取物， 11 将分离出的质粒DNA置于-20℃保存备用。 超螺旋快于。碱法提的质粒三条带中有螺旋，开环另外一条不是线性的DNA，在提取中线性DNA被降解。 μl，做4组： 第一组 第二组 第三组 第四组 质粒来源 1号管质粒 1号管质粒 2号管质粒 2号管质粒 10 × 酶切缓冲液（M） 2.5 μl 2.5 μl 2.5 μl 2.5 μl 质粒DNA 7.5μl （0.5~1.0 μg） μl （0.5~1.0 μg） μl （0.5~1.0 μg） μl（0.5~1.0 μg） EcoRI μl 不加