盐对疫苗的阳离子脂质体的物理化学性质及蛋白质免疫原性的影响.docVIP

盐对疫苗的阳离子脂质体的物理化学性质及蛋白质免疫原性的影响 摘要 最近,我们已经研制了一种由一个阳离子脂质和一个抗原多肽组成的简单而有效的治疗癌症的疫苗。在这篇报告中,我们扩大了这种基于蛋白质组成的疫苗的效用。首先,我们用不同剂量的DOTAP脂质体制备了人乳头瘤病毒(HPV)16 E7蛋白(E7)。结果表明,这些组成未能抑制已形成了的肿瘤。然而,当在DOTAP(100 nmol)/ E7(20μɡ)配方中加入氯化钠（30μM）时，抗肿瘤活性在免疫的小鼠体内产生。相关地,在DOTAP / E7蛋白配方中，氯化钠的加入使粒径从350纳米增加到550纳米，同时降低了蛋白质负载力(从95%到90%),并且增加了zeta电位(从29 mV到 38 mV)。 接下来，在不同剂量的DOTAP脂质体中制备了一个模型蛋白质抗原卵清蛋白(OVA)。同样的,结果表明,在含有 30μɡ氯化钠的200nmol DOTAP中制备的20 g OVA有最好的包括IgG1和IgG2a 在内的OVA特性抗体反应, 说明在这个组成中同时产生了Th1与Th2免疫反应。总之,我们已经扩大了基于疫苗的阳离子DOTAP脂质体制备的蛋白质的应用,并且也明确了少量的盐可以改变疫苗配方的理化性质、提高基于疫苗的DOTAP /蛋白的活性。由盐份产生的免疫反应的提高很可能是由于阳离子脂质体和抗原蛋白质之间产生的相互静电力的干扰,同时可以促使抗原从载体释放、并激活抗原载体细胞。 1.简介 近代疫苗发展方向已由包含整个有机体的疫苗转向为了求得一个成功的免疫反应仅包含必需组成的更安全的副族疫苗。新一代疫苗体系基于蛋白、多肽或DNA而成,被认为是比基于减弱或杀死生物体的疫苗更安全的疫苗体系。为了产生强烈的T 或B-细胞介导的免疫反应,副族疫苗必须有效地将抗原传递给抗原呈递细胞(APC),同时激活APC【9,3，23】。最近我们已经发现一个由单一的DOTAP阳离子脂质组成的阳离子脂质体，它能将一个细胞毒T淋巴细胞(CTL)决定肽E7转运到树突状细胞(DC)，并且使鼠类宿主对含有人乳头病毒(HPV)DNA 的TC-1肿瘤细胞的生长产生免疫【4】。 因此,治疗癌症疫苗只含有两种分子:抗原与辅助体。DOTAP脂质体,除了有高效转运活性,还必须能激活DC。 有趣的是,阳离子脂质体能激活树突细胞上CD80 / CD86的表达,但不是从DC上释放肿瘤坏死因子【19】。 树突细胞通过DOTAP脂质体的激活导致活性氧化物的产生和多种信号通路的激活,其中包括ERK(细胞外信号调节的蛋白【25】。 最终,DOTAP脂质体诱导趋化因子/细胞因子的生产和协同刺激分子表达【24】。 在已免疫的宿主细胞内，一个蛋白质制成的疫苗能够诱导抗体反应和T-细胞反应。此外,一种含有包括T-辅助（Th）细胞抗原表位在内的多种抗原表位的蛋白质,它在肿瘤免疫中扮演了一个重要的角色,例如,体内CD8+ T-细胞反应的准备过程【20】和／或记忆的产生过程【1】 。在人类种群中， MHC(主要组织相容性复合体)I和II分子里高度特异的单体型的存在也使得整个蛋白质能够去转运有吸引力的分子【16】。 众所周知，质粒DNA(pDNA)-阳离子脂质体复合物会导致全身的基因表达,特别是在肺部的表达【27】【21】【14】【12】。由于随着盐浓度升高脂类复合物有明显聚集的趋势，所以经常在非离子型溶液中制备它们【10】。在等渗溶液里（150mM氯化钠溶液）脂复合物的形成过程中，聚集可能是由伴随的反荷离子平衡了表面的极性引起的，因此降低了脂类复合物之间的排斥。 有趣的是,在化合物形成期间低浓度盐分（10mM氯化钠溶液）的添加会增加肺部基因的表达【11】。 各种各样脂质成分的脂类复合物已经被广泛的用作抗原来转运蛋白质【6】【18】【5】。 然而,盐在阳离子脂质体/蛋白质复合体的理化性质方面和免疫原性方面的影响,尤其是对T细胞反应的影响,仍是未知的。 我们认为阳离子脂质体/蛋白复合体中盐分的加入也可以促进免疫反应是由于其理化性质的改变。在此,我们提出：阳离子DOTAP脂质体 /蛋白质/盐复合物是一种蛋白抗原，它充当一个有效的辅助/转运系统并且诱导了有效的蛋白抗体和CTL反应。 2.材料和方法 2.1．材料 DOTAP(1，2-二油酰-3-三甲基丙烷)和其他脂质、完备和不完备的弗罗因德佐剂(CFA(IFA)、生物素化羊抗小鼠IgG,IgG2a和IgG1辣根过氧化物酶（HRP）轭合物 2.2．重组E7蛋白质的纯化 质粒pET-E7是一份来自位于韩国天主教大学（韩国，首尔)的Jeong-Im Sin博士的礼物。组氨酸标记的重组E7蛋白质就像预先经过修饰所描述的那样被表达和纯化【5】。 简而言之,pET-E7质粒被纯化和转化到了BL21(DE3)细胞内。在最终浓度为5