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间接ELISA法测定抗人白蛋白效价 摘要：目的 我们通过运用间接ELISA法，来测定羊抗人白蛋白的效价。方法 在以往的实验中，我们大多运用的是ELISA法来测定，这次，我们运用的是间接ELISA法。结果在包被的人ALB浓度为0.1~0.01ug/ml时，测出的抗人ALB的效价为1：10240。结论 运用间接ELISA法，在检测抗人ALB的灵敏度高，优化了反应条件，可用于初步抗人ALB的检测。 【关键词】间接ELISA法 抗人白蛋白 效价 间接ELISA法，是目前最常用的方法，因其灵敏度高，操作简便而被运用广泛。此方法是测定抗体最常用的方法，属于非竞争结合试验。其原理是将抗原连接到固相载体上，样品中待测抗体与之结合成固相抗原-受检抗体复合物，再用酶标二抗与固相免疫复合物中的抗体结合，形成固相抗原-受检抗体-酶标二抗复合物，测定加底物后的显色程度，确定待测抗体含量。此次试验就是用间接ELISA测定未知的抗人ALB的效价。 1.材料与方法 1.1 试剂 0.1M PH7.4 PBS缓冲液、洗涤液:0.05%Tween-PBS、1%酪蛋白溶液、硫酸溶液（学校实验室提供）、人ALB（SIGMA:A1653 SIZE:250MG storage:2-8℃）、羊抗人ALB（效价1:70 批号：201106 贮存于4-20℃，有效期：2年）、显色液（A液、B液Cat:ME002 可溶性TMB显色液)、酶标抗体（兔抗羊--HRP，武汉博士德生物工程有限公司） 1.2器材 塑料试管、微孔反应板、封片纸、试管架（学校实验室提供）、移液器（上海荣泰生化工程有限公司；Thermo移液器）、洗板机（BIO-RADMODEL1575Immunowash）、SM-3自动化酶免分析仪（北京天石医疗用品制作所）、电热恒温培养箱（上海恒科学仪器有限公司） 1.3原理与方法 包被抗原 ↓温育洗涤3次 加封闭液 ↓温育洗涤3次 加入标本 ↓温育洗涤5次 加入酶标记抗体 ↓温育洗涤5次 加入底物 ↓温育 加入终止液 ↓ 检测 1.3.1确定包被的抗原及兔抗羊IgG-HPR的工作浓度，首先从大范围对人ALB包被浓度及羊抗人IgG-HPR的浓度进行探索，即人ALB:0.01ug/ml、0.1ug/ml、1.0ug/ml、10.0ug/ml，羊抗人IgG-HRP:1：500、1：2000、1:8000:、1:32000，按下表进行操作，根据大范围检测初步确定人ALB包被浓度及羊抗人IgG-HRP的大致工作浓度。 1.3.2确定抗人ALB所需的反应体系 一抗 二抗 1：10 1：20 1：40 1：80 1：160 1：320 1：640 1：1280 1：2560 1：5120 1：10240 PBS 1：8000 1：16000 1：32000 1.3.3操作步骤 包板：将包被抗原用碳酸盐缓冲液稀释到0.01-10ug/ml，于微孔反应板中加入100ul/孔，4℃过夜后弃孔内液体，用洗涤液洗板5次。 封闭：加入300ul 1%酪蛋白溶液，4℃过夜弃孔内液体，用洗涤液洗板5次。 加入一抗：用PBS将待测血清稀释成不同的倍数，按上图加入待测血清浓度100ul/孔，37℃孵育1h，洗板5次。 加酶标二抗：每孔加入100ul/孔，混合，37℃孵育30min，洗板5次。 加底物：每孔加入显色液A 50ul/孔，显色液B 50ul/孔，混匀，孵育15min。 终止反应：每孔加入100ul终止液，混匀，终止反应。 测OD值：在1h内，用酶标仪测450nm波长处OD值（参比波长630nm）。 1.4计算 各样品OD值，比上空白对照的OD值即为ROD值，ROD值大于等于2.1即为阳性，此稀释度即为该标本的效价。 2.结果 2.1确定的抗原和兔抗羊IgG-HRP的工作浓度 在所有的包被抗原的浓度中，人ALB的浓度为0.1ug/ml，0.01ug/ml，数据的梯度和空白对照的数据最好，数据如下表1、表2。 2.2羊抗人ALB的效价的确 根据测定的OD值与空白值的比大于2.1中，稀释浓度最高的即为最高效价，