天然高分子在肌腱组织工程中用于细胞外基质的构建.docVIP

　　天然高分子在肌腱组织工程中用于细胞外基质的构建 --摘要:胶原与壳聚糖是2种具有较好生物相容性和一定力学强度的天然高分子,可在肌腱组织工程中用于细胞外基质的构建,但二者单独使用时各有不足。本研究利用二者性能上的互补,在一定的外力场作用下,采用EDC/NHS对2种天然高分子材料进行共价交联,获得具有一定空间取向和力学强度的多孔支架,然后引入细胞黏附因子RGD进行表面修饰,构建了具有较好组织相容性和细胞亲和性及适当降解速率的人工肌腱组织细胞外基质。对基质材料的力学性能、亲水性、体外降解速率等的检测和显微观察,结果显示:所构建的多孔支架材料柔软富有弹性,抗拉强度达:15.0Mpa,相应形变为:7.33%;孔隙率:79.4%;吸水率:772%;保水率:206%;在RPM1640培养液(含10%胎牛血清)和人血清中,3周总降解率分别为4.13%和37.2%,其降解速率可与肌腱修复周期相吻合,RGD修饰后材料对3T3-L1细胞具有较好的亲和性。有望成为理想的人工肌腱组织和人造皮肤细胞外基质,或整形手术的软组织填充材料。 关键词:天然高分子,人工肌腱,细胞外基质,表面修饰 临床肌腱损伤修复主要有3种途径:自体移植,这将造成新的组织缺损;异体移植,存在免疫排斥及供体严重不足等问题;人工肌腱替换,即组织工程化肌腱替换,是一种理想的组织损伤修复方式,目前仍处研究阶段,它是根据肌腱的生物学特征和力学性能,利用组织工程学技术体外构建人工肌腱,用于体内移植替换受损肌腱。组织工程化肌腱具有活力和功能,植入后可与受体肌腱愈合,永久性替换缺损肌腱;不仅解决了供体问题,还可任意塑形,在重建功能的同时达到形态修复的目的。目前支架材料降解与细胞功能同步增长化、模拟人体的三维张力环境构造基质及细胞在材料上的黏附、增殖和功能分化等问题仍需进一步研究[1,2]。 天然高分子材料在构建组织工程细胞外基质上具有许多优越性,如广泛、无毒、亲水、生物相容性及细胞亲和性好,且保留了正常组织内的网架结构,能够为种子细胞的黏附、增殖、分化和分泌细胞外基质提供三维结构。但在强度、加工性能和降解速率控制等方面有待提高。本研究利用壳聚糖和胶原2种天然高分子性能上的互补[3,4],构建天然高分子复合基质,并通过化学交联及表面修饰,进一步改善材料的力学性能,降解速率及对细胞的亲和性,构建能满足肌腱组织生物学及力学性能要求的细胞外基质,有望成为较理想的人工肌腱组织细胞外基质材料[5,6]。 1材料与方法 1.1材料 I型胶原:自制I型胶原;壳聚糖:由潍坊科海甲壳素有限公司提供,脱乙酰度90%,粘均分子量30万;碳化二亚胺[EDC]:上海源聚生物科技有限公司;N-羟基琥珀酰亚胺(NHS):上海伯奥生物科技有限公司;2-吗啉乙烷磺酸(MES):Amresco公司;RGD三肽(GRGDSP系列):Sigma公司;人血浆:武汉理工大学校医院提供;3T3-L1细胞:华中科技大学同济医学院细胞学实验室提供。 1.2方法 1.2.1基质材料的构建 壳聚糖溶于0.3 mol/L醋酸溶液制成2.5%溶液,I型胶原溶于蒸馏水溶液制成5%溶液,去离子水透析24 h,稀碱溶液调至pH 5.0左右,按质量比m胶原:m壳聚糖分别为2:1、1:2、1:4、1:8的比例混合,加入20 mmol/L的Ca2+溶液2 mL,单向充分搅拌均匀,再按每克胶原0.05 mmol EDC和0.01 mmol NHS的量加入EDC(30 mmol/L)和NHS(10 mmol/L)的混合溶液[5,7](临用前配制,立即加入),按同方向充分搅拌均匀,置往复式摇床中低速摇动,室温反应4 h,消泡过夜,?20oC低温冷冻48 h,冷冻干燥,制成各种外形的材料。 将所制材料依次浸于95%﹑75%﹑50%﹑20%等不同浓度的定型液中各0.5 h,取出,室温自然凉干,蒸馏水充分漂洗。 1.2.2基质材料的表面改性 RGD即“精-甘-天冬”氨基酸三肽是粘附蛋白的活性结构,与细胞粘附、移动及识别等有关,常将其接枝到人工材料表面以赋予材料生物学功能信号,促进细胞黏附及其后细胞功能的表达。Hhersel U及Myles JL等研究表明[8,9],RGD作为细胞黏附因子,其活性与含RGD的肽系列有关,GRGDSP的促黏附作用高于单纯的RGD三肽,故本试验采用GRGDSP系列对所制备的支架材料进行修饰。 低温条件下[10],将支架材料置于含33 mmol/LEDC和20 mmol/L NHS的50 mmol/L的MES溶液中充分浸润,随即加入2 mg/mL GRGDSP溶液500μL,混匀,反应24 h后取出,蒸馏水洗涤,自然干燥。 1.2.3材料形态及显微观察 材料纵向切片,倒置显微镜观察,切面电镜扫描观察。 1.2.4材料理化性能检测 1)拉伸强度:将材料