实验二蛋白质颜色反应与蛋白质含量测定课件.ppt

实验二、蛋白质的颜色反应及含量测定;一、实验目的;二、实验重点难点;三、实验原理;3.2 蛋白质与氨基酸的颜色反应总结;3.3、双缩脲反应;双缩脲法测蛋白质浓度操作简便、迅速，蛋白质浓度与光密度的线性关系好，是蛋白质浓度分析的常用方法之一，但本法缺点是灵敏度低，蛋白质量须在1-20mg/mL测定结果较准确。在需要快速、但准确性要求不高的测定中常用此法。;3.4、茚三酮反应;3.5、米伦氏反应（Millon反应）;3.6、黄色反应;3.7 常用测定蛋白质浓度的方法;3.8、考马斯亮蓝法;蛋白质含量在0-100μg范围内，蛋白质-色素结合物符合比尔定律，在595nm下的吸光度与蛋白质含量成正比，故可用比色法进行定量分析。 考马斯亮蓝G-250法（Bradford法）是比色法与色素法相结合的复合方法，简便快捷，灵敏度高，稳定性好，是一种较好的蛋白质常用分析方法。;PROTEIN;4、实验步骤;茚三酮反应：取1支试管加入蛋白质溶液10滴，再加10滴0.1%茚三酮水溶液，混匀，在酒精灯上加热，观察颜色由透明到乳白色、红色，再到紫红色，再变蓝。注：此反应需在pH:5-7时进行 黄色反应：取1支试管加入蛋白质溶液10滴，再加3-4滴浓硝酸，混匀，在酒精灯上加热，黄色，冷却后加4-5ml 10% NaOH，观察颜色变为橘黄色。;考马斯亮蓝法测蛋白质标准曲线制作 取7支试管，按下表操作。 试管编号 0 1 2 3 4 5 6 7 标准蛋白溶液1 (mL) 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 样液1 1mL 卵清蛋白1ml 0.9%NaCl溶液（mL） 1.0 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 0 0 考马斯亮蓝试剂(mL) 4 4 4 4 4 4 4 4 蛋白质浓度(?g/mL) 0 10 20 30 40 50 ？ ？ A595nm 摇匀，1 h内以0号试管为空白对照，在595nm处比色 OD595nm 以OD595nm为纵坐标，标准蛋白含量为横坐标，在Excell上绘制标准曲线。 根据所测样品提取液吸光值，在标准曲线上查得相应的蛋白质含量（μg），按下式计算：;双缩脲法测蛋白质标准曲线制作 取14支试管，分两组按下表平行操作。 试管编号 0 1 2 3 4 5 6 7 标准蛋白溶液2 (mL) 0 0.3 0.6 0.9 1.2 1.5 样液2 3mL 卵清蛋白3ml 蒸馏水（mL） 3.0 2.7 2.4 2.1 1.8 1.5 0 0 双缩脲试剂(mL) 2 2 2 2 2 2 2 2 蛋白质浓度(mg/mL) 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 ？ ？ A595nm 充分混匀后，显色后30min内测定A540，否则会有CuO2形成。??????;6、讨论;7、注意事项;8 作业