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　　浅议一种简便快速检测丁丙诺啡的方法在单克隆抗体的实验 --浅议一种简便快速检测丁丙诺啡的方法在单克隆抗体的实验 [摘要]目的采用免疫竞争法原理,建立一种简便快速检测丁丙诺啡的方法。方法将20nm胶体金颗粒标记的抗丁丙诺啡单克隆抗体,均匀浸在吸水玻璃纤维上,将丁丙诺啡-BSA和纯化后的羊抗鼠IgG多克隆抗体在硝酸纤维薄膜分别划1mm宽的检测线(T线)和质控线(C线),制成丁丙诺啡胶体金标记单克隆抗体免疫层析检测条,并组装成检测板。结果以GC/MS为标准对照,100例样品检测结果显示,本检测板的准确率为99.0%。丁丙诺啡胶体金标记单克隆抗体免疫层析检测板在对45种药(毒)物的测试中,仅识别丁丙诺啡及其主要代谢产物。结论丁丙诺啡胶体金标记单克隆抗体免疫层析检测板在5min内可检出样品中的丁丙诺啡及其代谢物,检测丁丙诺啡的阈值为100ng/mL。 [关键词]免疫层析 丁丙诺啡试剂盒 胶体金 单克隆抗体 Abstract:Objective To develope an easy to use,rapid and accurate test for detecting buprenorphine based onthe principle of petitive immunoassay.Methods Monoclonal antibody against buprenorphine ouse IgG polyclonal antibody embrane as the test line(Tline)and the control line(C line).The rapid test kit bled product of test strip ples munochromatographic and GC/MS methods.the accuracy ples in 5 minutes.The cut-off valueof the test is 100 ng/mL. Key munochromatographic assay;buprenorphine test kit;colloidal gold;monoclonal antibody 丁丙诺啡(buprenorphine)是国家严控的I类精神药品。目前检测丁丙诺啡的主要方法是GC/MS,但其检测速度慢,操作周期长,且价格昂贵,不能在现场检测,难以推广。为此,本研究建立一种简便、快速、灵敏、可靠、价格便宜,且适用于现场即时定性筛选检测、易于基层单位掌握的丁丙诺啡快速检测的新方法,即丁丙诺啡胶体金单克隆抗体免疫层析试剂盒。 1材料和方法 1.1材料羊抗鼠IgG多克隆抗体和抗丁丙诺啡单克隆抗体为本所自制(BUP-1);BSA和氯金酸(HAuCl·412H2O)为Sigma产品;硝酸纤维素膜为Millipore公司产品,孔径为8μm;玻璃纤维纸为英国an公司产品;Sorvall低温高速离心机为美国科峻仪器公司产品;BeckmanDu530分光光度计为美国Beckman公司产品;点膜机和切板机均为Bio-Dot公司产品;丁丙诺啡标准品为国家麻醉品实验室提供,试剂盒的塑料件由上海升惠塑料制品有限公司提供。 1.2方法 1.2.1胶体金的制备参照文献[1-3],采用柠檬酸钠还原法。用去离子水配制0.25×10-3mol/L(0.01%)的氯金酸溶液100 mL加热至沸腾,迅速加入34×10-3mol/L(1%)柠檬酸钠溶液2 mL,继续煮沸10 min,冷却后,即成胶体金颗粒。按照文献[4],用BeckmanDu530分光光度计对胶体金在可见光范围(400～600nm)进行扫描,发现其主峰宽度较小,表明制备的胶体金颗粒较均匀;其λmax为521nm,表明其粒度为20nm[5]。用20nm胶体金颗粒标记抗丁丙诺啡单克隆抗体。 1.2.2最适标记蛋白量的确定上述方法制备的胶体金溶液用0.1 mol/L K2CO3调至pH9.0后,在1.0mL的胶体金溶液中加入不同量的抗丁丙诺啡单抗,2min后,加入1.0mL的10%NaCl,摇匀,放置5min后,测OD580nm值。 1.2.3胶体金-抗丁丙诺啡单克隆抗体结合物的制备用ProteinA亲和层析纯化抗丁丙诺啡单克隆抗体,以纯水透析过夜,12000r/min离心去沉淀后,将其浓度调节到1.0mg/mL;取100mL胶体金,用0.1mol/LK2CO3将胶体金溶液调至pH9.0,在磁力快速搅拌下加入抗丁丙诺啡单克隆抗体1.5mg(1.5mg/mL),搅拌15 min;加入200 mg的BSA,搅拌10 min后,以1500r/min离心10min,弃沉淀,上清液再以12000r/min离心30min,小心吸去上清,沉淀即为胶体金-抗丁丙