18流式细胞术检测细胞内细胞因子方法的建立.docVIP

18-流式细胞术检测细胞内细胞因子方法的建立 上海第二医科大学生物物理教研室（200025） 史桂英 石学耕 附属仁济医院风湿病科（200001） 胡大会 陈顺乐 摘要 目的 建立流式细胞术检测细胞内细胞因子的方法。 方法 运用荧光标记的抗细胞表面抗原单抗及搞细胞因子单抗，结合固定、破膜处理技术，检测产生IFN－γ、IL－4的CD4＋、CD8＋细胞以及产生IL－10的CD3＋细胞。同时以相应同种型IgG染色细胞作为阴性对照，以确定细胞因子染色的特异性。 结果 产生IFN－γ的CD4＋及CD8细胞明显多于产生IL－4的细胞，并且产生IFN－γ的CD8＋细胞百分比较CD4＋细胞细胞相对增多；同时产生IFN－γ/IL－4的CD4＋、CD8＋细胞以及产生IL－10的CD3＋细胞都较少。 结论 该方法可从单个细胞水平直接检测全血标本中T细胞亚群和单核细胞等细胞因子的分泌。 关键词 流式细胞技术 细胞因子 细胞表型分析 中图号 R392.33 细胞因子（cytokine）是一类具有生物活性的小分子多肽或蛋白质，与免疫应答、炎症反应等密切相关：辅助性T细胞根据其产生的细胞因子及功能不同，可分为Th1/Th2两大类。Th1细胞分泌IL－2、IFN －γ及TNFβ，主要参与细胞免疫；Th2细胞分泌IL－4、IL－5、IL－6及IL－10，主要参与体液免疫。Th1/Th2细胞之间相互调节、相互平衡，其平衡失调与自身免疫病等多种疾病的发生有关系〖1〗。 细胞因子检测是判断机体免疫功能的一个重要指标。目前检测细胞因子的方法很多，主要有生物活性测定法、免疫学测定法及运用分子杂交技术或多聚酶链反应技术检测细胞因子mRNA表达等〖2〗。流式细胞术检测细胞因子是近年来新建立的一种方法，该技术的突出特点是在单个细胞水平进行测定，可在同一细胞内同时检测两种或更多种细胞因子，可根据细胞免疫表型区分不同的细胞亚群，进行多参数相关分析〖3〗，此方法目前国内未见报道。 材料与方法 材料 主要单抗：Cy-chrome标记的抗CD4单抗（RPA－T4克隆），Cy-chrome标记的抗CD8单抗（RPA－T8克隆），Cy-chrome标记的抗CD3单抗（UCHT1克隆），PE标记的抗IL－10单抗（JES3－19F1克隆），FITC标记的抗IFN－γ单抗（4S.BS克隆）PE标记的鼠IgG1同种型对照免疫球蛋白（R3－34克隆），PE标记的鼠IgG2a同种型对照免疫球蛋白（R35－95克隆），FITC标记的鼠IgG1同种型对照免疫球蛋白（MOPC－21克隆），Cy-chrome标记的鼠IgG1，κ同种型对照免疫球蛋白（MOPC－21克隆），均购自PharMingen公司。 其它试剂：PMA、离子霉素（ionomycin）、A23187、Monensin、DPBS、皂素（saponin）、多聚甲醛（PFA）等均购自Sigma公司，IMDM培养基、胎牛血清等购自GIBCO BRL公司，红细胞裂解液购自PharMingen公司。 实验对象 上海仁济医院健康职工。男1例，女4例，平均年龄28岁。 实验方法 细胞培养 静脉采血1mL，肝素抗凝，按1：1与IMDM培养基混匀，加PMA 20ng/mL, Ionomycin 1μmol/L或PMA 50ng/mL，A23187 250ng/mL作刺激原，同时加蛋白质转运抑制剂monensin 2μmol/L，以阻止细胞因子分泌至细胞外。混匀后，每200μL稀释血分加于5mL聚苯乙烯塑料管，37℃、5％CO2培养4～8h。 表面抗原及细胞因子染色 细胞培养后，每管加2mL红细胞裂解液，混匀后室温避光10min，1000r/min离心5min，弃上清。2mL缓冲液（含3％热灭活的胎牛血清及0.1%叠氮钠的DPBS缓冲液）洗1次，1000r/min离心5min，弃上清。然后分别加Cy-chrome标记的鼠抗人CD4、CD8、CD3单抗20μL，室温避光15min。2mL缓冲液洗1次，1000r/min离心5min，弃上清。每管加4％多聚甲醛500μL，固定20min，1000r/min离心5min，弃上清，然后每管加含0.1%皂素的缓冲液2mL破膜10min,1000r/min离心5min,弃上清。再用抗细胞因子单抗（0.2μL/管）室温避光孵育30min，2mL含0.1%皂素的缓冲液洗1次，1000r/min离心5min，弃上清。最后每管用500μLPBS/2％多聚甲醛悬浮细胞。 流式细胞术检测及分析 流式细胞仪FACScan（Becton Dickinson）进行检测，激发光为氩离子激光488nm谱线，以前向散射光（FSC）及侧向散射光（SSC）“开窗”（Gat