幽门螺杆菌 γ谷氨酰转肽酶基因的克隆及序列分析.doc

　　幽门螺杆菌 γ谷氨酰转肽酶基因的克隆及序列分析 ：唐炜， 张尤历， 王文兵， 陈慧娟 【摘要】 目的： 克隆不同疾病的幽门螺杆菌(Helicobacter pylori, Hp)γ谷氨酰转肽酶（Gammaglutamyltranspeptidase，GGT）基因，并进行序列分析。方法： 从人胃黏膜组织中分离培养获得Hp，提取其基因组DNA，对GGT基因进行 PCR扩增，克隆进 pMD18T 载体，进行测序和生物信息学分析，并与基因库中公布的标准株26695和J99的GGT氨基酸序列进行比对分析。结果： 成功克隆了分别于慢性胃炎，胃溃疡，十二指肠溃疡和胃癌的4种Hp菌株GGT片段，并进行了序列分析。4种病源的Hp GGT序列大小均为1 704 bp，编码 567 个氨基酸，理论分子质量是61 kDa，等电点是9.3，在N端具有信号肽，含有ATP蛋白激酶结合结构域和γ谷氨酰转肽酶保守结构域。序列比对分析显示，不同的Hp菌株GGT具有很高的保守性。结论： GGT在Hp中高度保守，具有分泌作用，可能对宿主细胞产生影响。该基因的成功克隆为进一步研究其功能打下了基础。 【关键词】 幽门螺杆菌； γ谷氨酰转肽酶； 基因克隆； 序列分析； 信号肽 ［Abstract］ Objective: To clone and analyze the γglutamyltranspeptidase(GGT) gene of Helicobacter pylori(H.pylori).Methods： The strains of H.pylori human gastric mucosa edium.The GGT amplified by PCR from H.pylori DNA atics method.The sequences ino acids inal and there yltranspeptidase signature.The sequence analysis shoino acid sequences ino acid and has an important role in host cells.Cloning this gene yltranspeptidase; gene cloning； sequence analysis; signal peptide 自从1983年ashall由人胃黏膜分离出幽门螺杆菌（Helicobacter pylori, Hp）后，Hp感染与慢性胃炎（chronic gastritis, CG）、胃溃疡（gastric ulcer, GU）、十二指肠溃疡（duodenal ulcer, DU）和胃癌（gastric cancer, GC）等疾病的关系逐步被人们所认识［1］。国际癌症机构已将Hp列为Ⅰ级致癌因子［2］。γ谷氨酰转肽酶(Gammaglutamyltranspeptidase，GGT)是一种催化肽基转移作用的酶，广泛存在于原核和真核细胞中［3］，在动物体内主要存在于肾、肝、胰等脏器，在谷胱苷肽的新陈代谢中起到了重要的作用［4］。Hp分泌的GGT通过抑制CD4+T细胞的增殖，从而抑制了CD4+T细胞对Hp的清除作用，可见GGT对Hp的定植有一定的作用［5］。GGT参与诱导Hp介导的程序性细胞死亡，可能是一个较好的抗肿瘤因子［6］。但程序性细胞死亡的持续发生，破坏了新细胞生成和细胞消亡之间的平衡从而产生病理作用［7］，凋亡调节基因的转变和突变的频繁发生，反而增加了胃癌发生的危险性［8］。有关GGT的生物学机制和在体内的效应还需要进一步的研究。本实验采用PCR技术分别扩增出了于胃炎、胃溃疡、十二指肠溃疡和胃癌的4种H.pylori菌株的GGT片段，并进行克隆和序列测定、序列分析，以了解GGT基因在致病过程中的变化情况，为进一步研究GGT的生物机制提供了依据。 1 材料与方法 1.1 材 料　 临床Hp菌株由本院内镜室活检标本分离培养获得。Hp基础培养基、微需氧环境发生袋、选择性抗生素及厌氧培养罐购自德国Merck公司。改良布氏肉汤培养基由上海腹泻疾病控制中心提供。无菌羊全血购自金坛欣迪公司。大肠埃希菌E.coli DH5α为江苏大学生命 科学 研究院实验室保存。pMD18T载体、LATaq酶、质粒抽提试剂盒为TaKaRa公司产品。酵母提取物、蛋白胨为OXOID公司产品。其他常规试剂为市售分析纯。 1.2 实验方法 1.2.1 Hp的培养 活检组织标本经快速尿素酶试验证实Hp阳性，结合胃镜和病理结果分析诊断为慢性胃炎（5例），胃溃疡（5例），十二指肠溃疡（5例）和胃癌（5例）。将于这4种疾病类型的活检新鲜组织用接种环均匀涂于固体琼脂培养基