应用等位基因特异性PCR检测胆固醇酯转运蛋白基因突变.doc

　　应用等位基因特异性PCR检测胆固醇酯转运蛋白基因突变 ：周代锋，蔡望伟，云美玲，张勇，习隽丽 ，王镇 【摘要】 目的：建立检测胆固醇酯转运蛋白(cholesterol ester transfer protein，CETP)基因6种常见突变的等位基因特异性PCR技术。方法：应用针对CETP基因TaqIB(G→A)、I405V(A→G)、D442G(A→G)、R451Q(G→A)、A373P(G→C)和I14A(G→A)这6种常见的突变位点设计的等位基因特异性PCR技术，对海南汉、黎族人群中CETP基因突变类型进行了检测，同时对经上述等位基因特异性PCR检测的样本进行序列测定。结果：在海南汉、黎族人群中，TaqIB(G→A)突变位点可检测出GG、GA、AA 3种基因型，I405V(A→G) 突变位点可检测出AA、AG、GG 3种基因型，D442G(A→G) 突变位点可检测出AA、AG 2种基因型，但在海南汉、黎族人群中未检测到R451Q(G→A)、A373P(G→C)和I14A(G→A)3种突变类型，用等位基因特异性PCR鉴定的CETP基因突变的基因分型结果与序列测定结果完全符合。结论：等位基因特异性PCR技术操作简便，重复性和稳定性好，可作为鉴定CETP基因突变类型的可行方法。 【关键词】 胆固醇酯转运蛋白基因;等位基因特异性;聚合酶链反应;基因分型 　　[ABSTRACT] Objective: To establish the allele specific polymerase chain reaction (ASPCR) technique for the detection of 6 normal mutations of cholesterol ester transfer protein (CETP) gene. Methods: Designed the ASPCR system according to the 6 mutations of CETP gene, TaqIB (G→A), I405V (A→G), D442G (A→G), R451Q (G→A), A373P (G→C) and I14A (G→A). Detected the mutations in Li and Han nationalities of Hainan province by the designed method and sequenced partial mutation samples. Results: 3 genotypes utation site utation site utation site utation sites plify is an effective method for investigation of the mutations of CETP gene. 　　[KEY gCl2)中含模板DNA 0.2 μg,每种引物0.2～0.5 μmol/L，每种dNTP为200 μmol/L,在加入1 U Taq DNA聚合酶(北京天根公司产品)后，置Tgradient 96梯度PCR仪中扩增， PCR扩增循环参数如下：首先在94 ℃进行2 min的热变性，随后进行32个循环反应(每个循环包括94 ℃ 50 s，退火条件见表1，72 ℃ 60 s)。将扩增产物在2%的琼脂糖凝胶中电泳，经EB染色在UVI band凝胶成像系统(英国UVI tec 公司产品)中观察结果并照相。 　　用上述建立的等位基因特异性PCR技术对301例海南汉族人样本DNA和330例海南黎族人样本DNA进行了CETP基因的检测。 　　1.3 CETP基因PCR扩增结果的DNA测序验证 　　随机抽取经上述建立的等位基因特异性PCR技术检测后分型出的各种CETP基因型的DNA样本，将表2中引物的PCR扩增特异DNA片段，送上海生工生物工程技术服务有限公司进行DNA序列测定。表2 DNA测序特异片段PCR扩增的引物序列、退火条件及扩增片段长度 　 　2 结果与分析 　　2.1 6种常见CETP基因突变位点的基因分型结果 　　每种CETP基因突变位点都利用突变型引物和野生型引物同时进行两管PCR扩增，根据每个样品两种等位基因扩增产物结果，可准确判定样品的基因类型。 　　应用建立的等位基因特异性PCR技术对301例海南汉族人样本DNA和330例海南黎族人样本DNA进行了CETP基因的检测。在海南汉、黎族人群中，TaqIB(G→A)突变位点可检测出GG、GA、AA 3种基因型，I405V(A→G) 突变位点可检测出AA、AG、GG 3种基因型，D442G(A→G) 突变位点可检测出AA、AG 2种基因型，但在海南汉、