应用等位基因特异性PCR检测血管紧张素原基因突变.doc

　　应用等位基因特异性PCR检测血管紧张素原基因突变 ：周代锋，张云霞，张勇，陈少华，李林江，习隽丽，王镇 【摘要】 目的：建立检测血管紧张素原(angiotensinogen，AGT)基因2种常见突变的等位基因特异性PCR技术。方法：应用针对AGT基因T174M和M235T这2种常见的突变位点设计的等位基因特异性PCR技术，对海南汉、黎族人群中AGT基因突变类型进行了检测，同时对经上述等位基因特异性PCR检测的样本进行序列测定。结果：在海南汉、黎族人群中，T174M突变位点可检测出TT、TM、MM 3种基因型，M235T 突变位点可检测出MM、MT、TT 3种基因型，用等位基因特异性PCR鉴定的AGT基因突变的基因分型结果与序列测定结果完全符合。结论：等位基因特异性PCR技术操作简便，重复性和稳定性好，可作为鉴定AGT基因突变类型的可行方法。 【关键词】 血管紧张素原基因;等位基因特异性;聚合酶链反应(PCR);基因分型 　　[ABSTRACT] Objective: To establish the allele specific polymerase chain reaction (ASPCR) technique for the detection of 2 normal mutations of angiotensinogen (AGT) gene. Methods: Designed ASPCR system utations in Li and Han nationalities of Hainan province toon mutations of AGT gene, T174M and M235T. The sequence of the ASPCR sample ultaneously. Results: Three genotypes utation site utation site plify is an effective method for investigation of the mutations of AGT gene. 　　[KEY 和M235T的多态性，笔者建立了简便、快速检测AGT基因上述2种突变的等位基因特异性PCR技术，现将结果报告如下。 　 　1 材料与方法 　　1.1 DNA样品 　　用EDTA抗凝，从海南省海口市随机采集海南籍汉族正常人群血液样本193份，从海南省昌江和陵水等市县随机采集海南籍黎族正常人群的血液样本153份，以上样本均为血缘上的无关个体，按Lahiri等[4]方法提取DNA。 　　1.2 等位基因特异性PCR扩增AGT基因 　　1.2.1 引物的设计与合成 从Genbank中获得人类AGT基因的DNA全序列和mRNA序列，用PCR DESN软件辅助设计引物，并委托上海生工生物工程技术服务有限公司合成，引物序列见表1。表1 等位基因特异性PCR的引物序列及扩增片段长度 　　1.2.2 PCR扩增 每个多态位点均设立2个PCR检测管，分别加入寡核苷酸正常和突变引物用于检测每个多态位点正常和突变的等位基因。反应体系如下：每管在1×PCR缓冲液(10mmol/L TrisHCl，pH8.3， 50mmol/L KCl， 1.5～2.0mmol/L MgCl2)中含模板DNA 0.2μg, 引物各0.2～0.5μmol/L， 4种dNTP各200μmol/L, Taq DNA聚合酶(北京天根公司产品)1U。PCR循环参数为：首先在94℃进行2min的热变性，随后进行32个循环反应(每个循环包括94℃ 50s，60℃50s，72℃60s)。扩增产物在2%的琼脂糖凝胶中电泳，经EB染色在UVI band凝胶成像系统(英国UVI tec 公司产品)中观察结果并照相。 　　1.3 AGT基因PCR扩增结果的DNA测序验证 　　随机抽取经上述建立的等位基因特异性PCR技术检测后分型出的各种AGT基因型的DNA样本，将AGT1和AGT2引物对的PCR扩增特异DNA片段，送上海生工生物工程技术服务有限公司进行DNA序列测定。 　 　2 结果 　　2.1 2种常见AGT基因突变位点的基因分型结果 　　每种AGT基因突变位点都利用突变型引物和野生型引物同时进行两管PCR扩增，根据每个样品两种等位基因扩增产物结果，可准确判定样品的基因类型。 　　应用建立的等位基因特异性PCR技术对193例海南汉族人样本DNA和153例海南黎族人样本DNA进行了AGT基因的检测。在海南汉、黎族人群中，T174M突变位点可检测出TT、TM、MM 3种基因型，M235T突变位点可检测出MM、MT、TT 3种基因型,见图1。 　　注：M为100bp 1与2、3与4、5与6分别为T1