抗人硫氧还蛋白1单克隆抗体的制备与鉴定及初步应用.doc

　　抗人硫氧还蛋白1单克隆抗体的制备与鉴定及初步应用 ：唐文心, 王建和, 陈正望, 陈孝平 【摘要】 　　目的: 制备抗硫氧还蛋白1（TRX1）的单克隆抗体(mAb)并进行特性鉴定。方法: 以原核表达的TRX1为抗原免疫BALB/c小鼠, 按常规方法进行细胞融合。采用有限稀释法和间接ELISA法克隆和筛选阳性杂交瘤细胞株, 用ELISA 检测mAb腹水的效价、 相对亲和力和进行表位分析, 用r）约为12 000, 属于进化保守的氧化还原蛋白家族, 具有活性中心(TrpCysGlyProCysLys), 它与TRX1还原酶和 NADPH共同构成调节细胞氧化还原状态的巯基氧化还原系统（TRX系统）。1964年TRX1在大肠杆菌中首次被发现至今［1］, 被证实广泛存在于原核、 真核生物中, 具有多种重要功能, 如抑制细胞凋亡、 增加转录因子活性, 刺激细胞增殖及血管生成, 作为DNA合成的辅助因子［2］。临床研究发现, 在氧化应激及炎症状态下包括HIV感染、 类风湿性关节炎、 Sjogren’s综合症、 急性冠状动脉综合征和扩张性心肌病等, 患者血清中TRX1水平将大大提高。更有趣的是, 许多人类恶性肿瘤中均发现TRX1的过表达, 包括肺癌、 直肠癌、 肝癌、 胰腺癌、 胃癌、 乳腺癌、 淋巴癌等［3］, 故将TRX1作为一项病理指标并提示可将TRX1及TRX1系统作为癌症治疗的新靶点, 具有潜在的应用价值。 　 　1 材料和方法 　　1.1 材料 表达载体pET32a, pcDNA3.1(+)大肠杆菌 DH5α和BL21, 人乳腺癌细胞MCF7细胞株由本实验室保存。 MMLV反转录酶, DNA限制性内切酶, T4 DNA ligase, KlenoAb）、 微管蛋白（βtublin）及其mAb、 牛血清白蛋白（BSA）、 BCA试剂盒及DMEM培养基均为Sigma公司产品。弗氏佐剂为Gibco BRL公司产品。4～6周龄雌性BALB/c小鼠（体质量18～22 g）购自湖北省实验动物研究中心。Sp2/0细胞由 中国 农业大学传染病与微生物学教研室提供。酶联免疫检测仪为Labsystems dragon公司产品。Sephadex G25凝胶柱为Phamarcia产品。IgG 亚类（型）ELISA检测试剂盒为Pierce公司产品。其他试剂均为国产分析纯。 　　1.2 方法 　　1.2.1 TRX1的原核表达及纯化 由上海生工生物工程技术服务有限公司合成引物对: P1 5′CGGAATTCAATGAACGGCCCTGAAGATCT3′; P2 5′CGGAATTCTCAGCAGCCAGCCTGGAGGA3′。提取人乳腺癌细胞MCF7总 RNA, 用MMLV反转录成cDNA, 以此cDNA为模板, P1和P2作为引物, 用高保真DNA聚合酶pfu进行扩增, 反应程序为: 94℃ 30 s, 55℃ 60 s, 72℃ 40 s, 循环30次。其产物和pcDNA3.1(+)载体连接得到pcDNATRX1。使用Kpn I和Xho I将从pcDNATRX1上将TRX1基因切下后克隆到pET32a的相同位点中, 得到原核表达载体pET32aTRX1。提取pET32aTRX1质粒转化大肠埃希菌 BL21工程菌, 以单菌落接种于 LB培养基（含氨比西林50 mg/L）中振荡培养过夜, 1%转接后继续振荡培养至A值为0.5, 加0.4 mmol/L IPTG诱导表达。将 BL21重悬于预冷的Tris缓冲液（pH7.9, 含5 mmol/L咪唑, 0.5 mol/L NaCl和20 mmol/L TrisHCl）中, 加入10 g/L Triton X100后超声破碎, 12 000 g, 10 min离心后取上清。将超声后的上清以15 mL/h的速度过Ni亲和柱, 再用20倍柱床体积的PBS（含0.5 mL/L Tbin蛋白酶于22℃轻柔振荡16 h, 用8 mL的PBS洗脱, 收集洗脱液。再用100 mmol/L咪唑洗脱标签蛋白。 　　1.2.2 免疫原BSATRX1的制备 参考 文献 ［ 4］, 将10 mg BSA溶于0.1 mol/L碳酸盐缓冲液(CB, pH9.0, 含9 g/L NaCl和1 g/L SDS)中, 加入2.5 g/L戊二醛水溶液20 μL, 避光反应1 h。反应液流经Sephadex G25凝胶柱以除去未反应的戊二醛, 0.1 mol/L pH9.0 的CB洗脱, 收集蛋白洗脱峰。在洗脱液中加入2 mg TRX1, 避光反应16 h后, 加入终浓度为1 mol/L的甘氨酸终止反应6 h。将反应液放入截流Mr为3 000的透析袋中, 于