抗重组蛋白rVVC多克隆抗体的制备及其保护作用的鉴定.doc

　　抗重组蛋白rVVC多克隆抗体的制备及其保护作用的鉴定 ：姚蔚，周建娟，李桂军，谢旦立，楼永良堃 【摘要】 目的:纯化rVVC免疫家兔，制备并纯化多克隆抗体。观察复性rVVC、纯化多克隆抗体、rVVC和纯化多克隆抗体混合作用肝癌细胞SMMC7721后，肝癌细胞SMMC7721形态学和活性变化，评估抗重组rVVC蛋白多克隆抗体对肝癌细胞SMMC772的保护作用。方法:纯化重组蛋白rVVC免疫日本大耳兔获得多克隆抗体，多克隆抗体经过硫酸铵盐析、Sephadex G25除盐和DEAE-Sephadex G100层析纯化并进行 MC7721后，显微镜观察并以MTT法确定抗重组rVVC蛋白多克隆抗体对肝癌细胞SMMC7721的保护作用。结果:兔抗重组rVVC多克隆抗体经盐析法、分子筛和阴离子交换层析法纯化后，得到较纯的IgG分子。免疫印迹结果显示，抗重组rVVC蛋白多克隆抗体与纯化抗原呈现特异性反应条带。显微镜观察和MTT结果表明，纯化多克隆抗体能够阻断重组rVVC活性蛋白对肝癌细胞SMMC772的损伤。结论:成功制备了具有保护和阻断作用的兔抗重组rVVC多克隆抗体，为以后rVVC促炎症、促应激作用机制和信号传导机制研究提供一个重要的阻断剂。 【关键词】 创伤弧菌溶细胞素；多克隆抗体；保护作用；阻断作用 Abstract: Objective: To prepare and purify rabbit polyclonal antibody against rVVC，to evaluate the protection of polyclonal antibody by observing the morphology and activity changes of SMMC7721 cells acted by purified rVVC，purified polyclonal antibody，the mixture of rVVC and polyclonal antibody. Method: Rabbit polyclonal antibody against rVVC prepared by immunning rabbit ixture of VVC and polyclonal antibody， rabbit polyclonal antibody protection icroscope and ethod. Result: Rabbit polyclonal antibody against rVVC ethods of Persulfate， Sephadex G25 and DEAE-Sephadex G100. Polyclonal antibody shomunoreactivity. The results of MTT and microscope observatien indicated that polyclonal antibody could block up the damage of SMMC7721 cells acted by rVVC. Conclusion: Rabbit polyclonal antibody against rVVC echanism of inflammation，stress and signal transduction of rVVC. Key g/ml，4 ℃条件下，取1 ml样品加到Ni-NTA亲合层析柱中，流速控制在15 ml/h左右，进行蛋白质挂柱。层析用10倍NTA体积的NTA-0 Buffer洗脱，流速控制在30 ml/h左右。再分别用3倍NTA体积的5.5、5.0、4.5、4.0、3.5、3.0、2.5、2.0、1.5、1.0、0.5 mol/L盐酸胍洗脱，流速控制在15 ml/h左右。3倍NTA体积的NTA-1 000 Buffer洗脱，收集洗脱液并用PBS溶液透析24 h，期间要求多次更换透析液。取透析好的蛋白溶液于4 ℃、12 000 r/min离心取上清液，以考马斯亮蓝进行蛋白质定量分析，滤过除菌， -70 ℃冻干保存。 1.2.2 重组蛋白rVVC溶血活性检测：将一定量复性重组rVVC蛋白加入1 ml 0.7%兔红细胞悬液中，再加PBS-BA缓冲液至2 ml，37 ℃水浴20 min，显微镜观察细胞形态学变化。2 500 r/min离心5 min，取上清于545 nm处测吸光度值，以使0.7%兔红细胞悬液中的血细胞溶血一半时所需的蛋白质的量定义为一个溶血单位来 计算 其溶血活性。 1.2.3 兔抗重组蛋白rVVC多克隆抗体的制备、提纯、MC7721细胞培养和活性检测：SMMC7721细胞用DMEM高糖培养基（