毒热平注射液抗流感病毒肺损伤机制的研究.doc

　　毒热平注射液抗流感病毒肺损伤机制的研究 ：张艳丽， 范新生， 李澎涛， 【摘要】 目的 研究毒热平注射液对流感病毒感染小鼠肺损伤的 治疗 机制。方法 用流感病毒亚甲型鼠肺适应株A/FM/1/47(H1N1)感染小鼠，建立小鼠流感病毒性肺炎的生物模型，用不同浓度毒热平注射液治疗后，观察流感病毒感染小鼠肺脏病理变化;Griess法检测肺匀浆NO含量;ELISA方法测定肺匀浆中IL-1和TNF-α的水平。结果 毒热平注射液各剂量组均能明显减轻肺脏病变;显著降低肺匀浆NO含量(Plt;0.001);各剂量组小鼠肺匀浆的IL-1 和TNF-α含量显著下降。结论 毒热平注射液可通过降低流感病毒感染小鼠肺组织炎症因子表达而发挥保护作用。 【关键词】 毒热平;流感病毒;肺损伤;NO 全球每年肺炎患者的死亡率超过其它感染性疾病[1-2]，呼吸系统是流感病毒侵袭的靶系统，“温邪上受，首先犯肺”。中医学认为流感的病机主要是“毒损肺络”，为感染性肺损伤，是流感病毒的致炎与机体的抗炎反应过程。毒热平注射液是根据长期临床实践基础上形成的中医理论-“毒损肺络”的病机理论，结合 现代 医学有关下呼吸道感染性疾病的病理过程及治疗的研究成果，配伍研制而成，具有清热解毒的功效。本实验旨在探讨毒热平注射液对流感病毒感染小鼠肺损伤的治疗效果及作用机制。 　 　1 材料和方法 　　1.1 材料 　　1.1.1 病毒 流感病毒亚甲型鼠肺适应株(FM1)， 中国 中医药研究院中医所提供，本实验室-76℃保存备用。于9 日龄鸡胚尿囊腔连续传代两次后，测血凝滴度为1∶512。 　　1.1.2 动物 ICR小鼠，体重(14±1)ɡ，合格证号：SLXK(京2005-2006)，级别：SPF/VAF。小鼠及饲料均由北京维通利华实验中心提供。饲养环境：本室动物室动物洁净柜，室温(22±2)℃，相对湿度(50±10)%。 　　1.1.3 药物 毒热平注射液，由黄芩、栀子、灯盏花和猪胆粉四味药物制成的中药复方注射剂，棕色液体，含提取物17.4 g·L-1，由广东康美药业有限公司开发提供;阳性对照药：注射用双黄连(冻干粉)：0.6 g干粉/支，实验前用无血清DMEM培养液配制成40 g·L-1备用，批号：0501004(哈药集团中药二厂);利巴韦林：0.1 g·mL-1，批号：0506251(石药集团欧意药业有限公司)。 　　1.1.4 试剂 细胞因子检测试剂盒购自美国Biosource公司。Griess 试剂：A 液为0.1%萘替乙二胺。B 液为5%的磷酸加1%的磺胺。避光4℃保存备用。使用时，A液和B液1∶1混匀即可。乙醚、生理盐水、75%酒精、组织病理切片HE染色材料由本室提供。 　　1.2 方法[3] 　　1.2.1 流感病毒对小鼠半数致死量(LD50)的测定[3]取ICR小鼠50只，用单纯随机抽样法随机平均分成5组，病毒为2-6～2-10 5个稀释度，参照 文献 [3]方法 计算 病毒的半数致死量(LD50)。 　　1.2.2 对流感病毒所致小鼠肺损伤的保护作用 取ICR小鼠70只，随机分组、给药见表1，造模方法见文献[3]。无菌摘取肺脏(每组取5只)，肉眼观察各组肺组织外观，用10%福尔马林液固定10d以上后制备组织切片行HE染色，显微镜观察照相。表1 动物分组和给药剂量 　　1.2.3 流感病毒感染小鼠肺匀浆细胞因子和NO的检测 取上述各组另5只鼠的肺脏，按 参考 文献[3]的方法制备肺匀浆。用双抗体夹心ABC-ELISA 法检测肺匀浆上清中IL-1和TNF-α含量，程序按照试剂盒说明书进行。同时取上述各组肺匀浆上清，加入96孔板中，100 μL/孔，再加入等量的Griess液，室温放置10 min，于酶标仪530 nm下测NO的 A值。 　　1.3 统计学方法 　　全部数据采用SPSS处理，计量资料的组间显著性比较用t检验。Plt;0.05 为有统计学意义。 　　2.3 病理形态观察 　　光镜下观察正常组小鼠肺泡、肺泡囊、肺泡管、肺泡隔形态完整，肺泡大小较一致，肺泡壁厚度正常，支气管上皮完整，管腔内无分泌物，胞浆呈红色，细胞核呈蓝色，外周未见炎细胞浸润(图1-A，见插页2)。模型组呈现重度间质性肺炎病变，小鼠肺泡、肺泡囊、肺泡管、肺泡隔、细支气管等正常的组织结构消失，结缔组织增生，大量淋巴细胞浸润，形成实变区，组织间见大量红细胞，血管内充血(图1-B，见插页2)。毒热平各剂量组肺组织形态结构较为完整，肺泡隔较正常组稍有增厚，偶见少量的淋巴细胞浸润(图1-C，见插页2)。 　　2.4 小鼠肺匀浆NO及IL-1、TNF-α含量测定 　　各组小鼠肺匀浆NO及IL-1和TNF-α的含量变化见表2。表2 毒热平注射液对流感病毒感染小鼠肺匀浆NO和IL-1、TNF-α