猪附红细胞体病PCR诊断方法的建立及应用.docVIP

　　猪附红细胞体病PCR诊断方法的建立及应用 ：巴彩凤，李久纯，冯会权，赵微 【摘要】 　　目的 建立一种新型的猪附红细胞体病PCR诊断方法。方法 根据猪附红细胞体部分CDS基因序列（AJ504999）设计引物，建立一种新的猪附红细胞体病PCR诊断方法。通过实验室染毒实验，建立感染猪附红细胞体病的小鼠模型，并应用研制的PCR方法进行实验室验证。应用建立的PCR诊断方法对辽宁5个城市的385个猪样本进行猪附红细胞体病流行病学情况调查，确定猪附红细胞体病的感染率。结果 成功建立猪附红细胞体病PCR诊断方法，通过染毒模型验证了该方法具有快速、特异性强、敏感性高的特点。并估计出辽宁省猪群中附红细胞体总体感染率95%的可信区间为（82.50%，89.44%）。结论 本研究建立的猪附红细胞体病PCR诊断方法及临床应用，为辽宁地区乃至全国附红细胞体病的防治工作提供了 科学 理论数据。 【关键词】 猪附红细胞体病 PCR 动物模型 感染率 　　Abstract: Objective To establish a neethod of mycoplasma suis(M.suis) .Methods The primers ethod. A mouse model ethod. The epidemiology situation of M. suis of 385 porcine blood samples in Liaoning Province ethod. Results It shoethod ethod 82.50% to 89.44% in province. Conclusions The study shoethod and its clinical application of M. suis provided the scientific theory data for the prevention and cure of M.suis in Liaoning Province even the ycoplasma suis; polymerase chain reaction; animal model; infectionrate 　　附红细胞体是一种专性血液寄生生物，寄生于多种动物和人红细胞表面、血浆及骨髓内，引起一种以溶血性贫血、黄疸、发热等为主要临床症状的人兽共患传染病［1］。近几年，猪附红细胞体病流行给 中国 的养猪业带来很大的损失。同时，对人类健康也构成了严重威胁。但是，目前缺乏附红细胞体的体外培养体系，严重地限制了其生物学系统分析和有效诊断方法的研究［2］。 　　传统的猪附红细胞体病的临床诊断主要基于光镜检查和血清学方法［3］，但特异性差，敏感性低，并存在一定的误诊，难以反映动物感染的真实情况。本实验在传统诊断方法的基础上建立一种新的猪附红细胞体病PCR诊断方法，实验室内通过动物模型验证其具有快速、特异性和敏感性。将该方法应用于辽宁省各大猪场的猪附红细胞体病流行病学调查研究，获得了可靠的研究数据。 　　 1 实验材料 　　1.1 样本 患病猪血样采自锦州某猪场，病猪为已确诊猪附红细胞体病，并排除其他病原体感染。流行病学调查样本来自于锦州市（35个）、凌海市（100个）、丹东市（100个）、铁岭市（100个）、大连市（50个）5个城市的385个随机抽查的猪样本。实验血样均经颈静脉采血，用柠檬酸葡萄糖(ACD)抗凝（ACD与血液抗凝比例为1∶5），4℃冰箱保存。 　　1.2 实验动物 健康昆明小鼠20 只由辽宁医学院实验动物中心提供。患病猪来自锦州某猪场。 　　1.3 主要试剂 DH5a感受态细胞、pMD18-T载体、DNA Marker 100bp、限制性内切酶EcoRⅠ、HindⅢ、蛋白酶K、 Taq DNA聚合酶等（TAKARA公司）；凝胶回收试剂盒及质粒提取试剂盒（AxyPrep公司）。 　　 2 实验方法 　　2.1 猪附红细胞体病PCR诊断方法的建立 　　2.1.1 猪附红细胞体基因组提取 传统的酚-氯仿方法提取猪附红细胞体基因组DNA，电泳及核酸定量仪测定其完整性及浓度，-20℃保存备用。 　　2.1.2 引物设计与合成 根据2003年Hoelzle等提供的猪附红细胞体部分CDS基因序列（AJ504999）设计引物，利用Oligo6.0和Primer5.0设计了一对引物F1（正向引物）：5 CAGCGGTGAGAAAGCAAG 3F2 (反向引物)： 5 GGTGCCCTTGCTGTCTCA 3扩增区域为ORF6－ORF9部分基因。引物序列由上海生工合成。 　　2.1.3 最佳退火温度的选择及PCR扩增 对临床20份猪血液样本分别进行镜检（血液压片、姬姆萨染色涂片）后