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人乳头状瘤病毒（HPV）实时荧光定量PCR 培训大纲 一、技术 所谓实时定量是指在指数扩增期间通过连续监测荧光信号强弱的变化来即时测定特异性产物的量，并据此推断目的基因的初始量。技术于1996年由美国Applied Biosystems公司推出。与常规相比，它具有特异性更强，有效解决产物污染、自动化程度高，同时能对起始模板进行准确定量等特点。该技术借助于荧光信号来检测产物，一方面提高了灵敏度，另一方面还可以做到每循环一次就收集一个数据，建立实时扩增曲线，准确地确定CT值，从而根据CT值确定起始DNA拷贝数，做到了真正意义上的DNA定量。这是DNA定量技术的一次飞跃。 1、 PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。实时荧光定量PCR反应是在常规的一对引物之外，加入一个两端带有荧光标记的寡核苷酸探针。在探针完好的状态下，5′端报告荧光基团的激发光被3′端的淬灭荧光基团所抑制。反应过程中，随着链的延伸，Ta酶沿着DNA模板移动到荧光标记探针的结合位置，发挥它的5′→3′外切核酸酶活性，将荧光探针切断，释放出报告荧光基团的荧光信号，每合成一个模板，一个报告基团的信号释放，被释放的激离报告荧光基团的数目和产物是一对一的关系。通过定量仪定时动态监测每一循环，可以得到样品实际扩增曲线，找到扩增的对数期。软件通过标准品的待测品的对数期比较，得到每一样品模板DNA的起始拷贝数。 PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光域值的缺省设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍，即：threshold = 10 ′ SDcycle 6-15 1.3. Ct值与起始模板的关系 研究表明，每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系〔1〕，起始拷贝数越多，Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代表Ct值（如图2所示）。因此，只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。 图2. 荧光定量标准曲线 1.4. 荧光化学 荧光定量PCR所使用的荧光化学可分为两种：荧光探针和荧光染料〔2〕。现将其原理 简述如下： 1）TaqMan荧光探针：PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5’－3’外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。如图3所示。 ? 图3. TaqMan 荧光探针工作原理 2）SYBR荧光染料： 在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。 2. 实时荧光定量PCR的特点： 2.1特异性 FQ-PCR具有引物和探针的双重特异性，故与传统的PCR相比，特异性大为提高。2.2敏感性 FQ-PCR的敏感度通常达102拷贝/ml，且线性范围很宽，为10-108拷贝/ml。一般 来讲临床标本中病原体的数目为0-1010/拷贝，在此范围内FQ-PCR定量较为准确，标本不需稀释。 2.3 重复性 FQ-FCR结果相当稳定，同一标本的CT值相同，但其产物的荧光量却相差甚大。 因为域值设置在指数扩增期，在此阶段，各反应组分浓度相对稳定，没有副作用，CT与荧光信号的对数呈线性关系。而当PCR反应进入平台期后，由于反应体系各组分的耗尽，酶活性的降低及产物的反馈抑制等原因导致产物不再增加。与终点法相比CT值能更稳定，更精确地反映起始模板的拷贝数。同时，因PCR是对原始待测核酸模板的一个扩增过程，任何干扰PCR指数扩增的因素如扩增孔间温度差异，标本中DNA聚合酶抑制剂的存在，加样的差异，待测标本中核酸模板的量等，都会影响扩增产物的量，因此，在扩增产物的数量与起始模板数量之间没有一个固定的比例关系，通过检测核酸产物很难对原始模板准确定量。 2.4 降低产物污染的风险性。 二、目前检测人乳头状瘤病毒（HPV）有哪些手段？ 目前临床上大多用形态学观察、血清学等检测方法，操作复杂而且灵敏度和特异性有限。 最近应用生物芯片和荧光定量PCR两大技术平台，分别成功地开发出可以同时对21个HPV亚型进行