掌握植物原生质体的分离纯化和培养技术了解原生质体再生细胞壁和.ppt

Protoplast Isolation and Cultivation Experiment 15 * 【实验目的】 掌握植物原生质体的分离、纯化和培养技术 了解原生质体再生细胞壁和细胞分裂的过程。 【实验原理】 植物细胞具有细胞壁。去除了细胞壁的裸露的植物细胞称为原生质体。高等植物和绿藻细胞壁的主要成分是纤维素和果胶质，其他藻类细胞壁的主要成份是纤维素和各种藻胶质。利用特定的酶水解细胞壁成分可以分离、获得大量的原生质体。分离得到的原生质体在适宜的培养条件下可合成新的细胞壁，进行细胞分裂，进而再生成完整的植株。 原生质体在细胞生物学研究中具有广泛的用途：①可进行原生质体融合，改变体细胞的遗传物质，克服远源杂交不亲和，建立优良的杂交新品种。 ②可用于细胞壁的生物合成、质膜的结构与功能、物质运输、能量转换、信息传递、细胞识别等生理生化研究中。 ③原生质体裸露的质膜可摄入外源DNA、细胞器、细菌或病毒颗粒，用于基因表达调控和植物遗传工程研究。 ④可用于研究染色体行为、基因定位、细胞器分离和细胞器的遗传操作等。 【实验材料】 一、材料：紫菜、礁膜、浒苔 二、器材和仪器：超净工作台、低速离心机、倒置显微镜、光照培养箱、高压灭菌锅、血球计数板、带盖离心管、细菌过滤器、300目镍丝网、剪刀、镊子、刻度吸管、培养皿、烧杯等 三、试剂： 1．洗涤液：灭菌海水，0.7 M甘露醇，25mM MES (pH 6.2)， 2．混合酶液：2%纤维素酶和1%果胶酶，溶于洗涤液中，过滤除菌。 3．培养基：灭菌的天然海水，添加40mg/L的N和4mg/L的P。 【实验方法】 1．取复苏的条斑紫菜、礁膜、浒苔叶状体各0.1g，用毛笔在海水中反复刷洗，去除藻体表面的附着物。在0.7%KI海水溶液中浸泡10min，用灭菌海水漂洗5次。 2．将无菌海藻叶片置20mL混合酶液中，用灭菌剪刀剪成细小的碎块，在20℃下，120rpm摇床上酶解3-4h，期间可用无菌吸管吸取酶解液，在显微镜下检查原生质体分离情况。 3．将酶解后的原生质体悬液用灭菌的300目细胞筛过滤，以除去未酶解完全的藻体碎片。 4．将原生质体滤液收集到离心管中，1000 g 离心10min。 5．用吸管小心吸除上层酶液，加入10mL洗涤液重悬沉淀，再次离心除去酶液。重复上述操作2-3次，洗净酶液与细胞碎片。 6．加入5mL海水培养基将原生质体重悬，在显微镜下用血球计数板计数四角上四个大格内的细胞总数，算出每毫升悬浮液中的细胞数 4 ×10000 ×稀释倍数 四大格的细胞总数 细胞数（个/mL）= 7．将上述原生质体悬液离心去掉加入的培养基，再按计数结果加入相应量的培养基，使培养基中悬浮原生质体的密度达到106个/mL。 8．用吸管将原生质体悬液转入灭过菌的培养皿内，控制液体的厚度在1mm左右，用封口膜封住培养皿，置20℃恒温光照培养箱中静置培养。 9．培养7天左右，在倒置显微镜下观察原生质体再生细胞壁与细胞分裂情况，并统计原生质体再生分裂率。 10．培养14天左右，在倒置显微镜下观察原生质体再生发育成幼叶状体和类愈伤组织等途径。 【作业与思考题】 1． 观察记录原生质体的酶解分离情况。 2． 观察并记录原生质体再生细胞壁和生长发育途径。 *