2.2 基因工程载体与工具酶.ppt

第二节 基因工程的载体和工具酶;一 基因工程的载体;1、载体的功能及特征;● 载体应具备的条件;2、质粒;● 质粒的基本特征;■ 质粒的不相容性;■ 质粒的可转移性;● 重要的大肠杆菌质粒载体 (Boyer);pUC18 / 19： ;pUC18 / 19：正选择标记 lacZ’ 的显色原理;根据蓝白斑选择转化子;● 质粒DNA的分离纯化;1、用含有EDTA的缓冲液悬浮菌体，加溶菌酶裂解细菌细胞壁； 2、加NaOH和SDS的混合溶液，去膜释放内含物； 3、加高浓度的醋酸钾溶液，沉淀染色体，去除染色体DNA及大部分蛋白质； 4、离心取上清液，用苯酚-氯仿萃取，去除痕量的蛋白质； 5、乙醇或异丙醇沉淀水相质粒DNA； 6、用无DNase的RNase去除残余的RNA（选择）。;2、噬菌体或病毒DNA;大肠杆菌的 l 噬菌体DNA;l-DNA载体的构建：缩短长度;l-DNA载体的构建： 插入型载体;l-DNA载体的构建： 取代型载体 (Blattener);l-DNA载体的构建：删除重复的酶切位点;l-DNA载体的构建：加装选择标记;l-DNA可在体外包装成噬菌体颗粒，能高效转染大肠杆菌 。 l-DNA载体的装载能力为25 kb，远远大于质粒的装载量 。 l-DNA载体适合克隆和扩增外源DNA片段，但不适合表达外源基因。;l-DNA重组分子需在体外人工包装成有感染力的噬菌体重组颗粒，方可高效导入受体细胞。 用于体外包装的蛋白质可直接从感染了l噬菌体的大肠杆菌中提取，现已商品化。; ;能像l-DNA那样进行体外包装，并高效转染受体细胞。 能像质粒那样在受体细胞中自主复制。 装载量大（45 kb）且克隆片段具有一定的大小范围。 不能体内包装，不裂解受体细胞。;二 基因工程的工具酶;1、限制性内切酶;限制性内切核酸酶： 在特异位点上切割DNA分子 分三类，常用为Ⅱ类酶 识别序列呈回文对称 命名：酶来源的生物名称缩写 属名-种名-株名-发现次序 ;限制性核酸内切酶的命名; ;5’NNNNNNNGAATTCNNNNNNNN3’ 3’NNNNNNNCTTAAGNNNNNNNN5’; 5’NNNNNNGTTAACNNNNN3‘ 3’NNNNNNCAATTGNNNNN5‘;限制性内切酶识别特定的碱基序列;竭酥中胶底坍墩涕柄芬榜颇啤恳姬赁衫掩谓细唯施筷琐垣肇侧姿唇做挫支2.2 基因工程的载体和工具酶2.2 基因工程的载体和工具酶;单娘酞板而削吠诅较瘸叼鳃矫奶硷碟促章???讽创连渊卉酱邵烽战琳睦窃量2.2 基因工程的载体和工具酶2.2 基因工程的载体和工具酶;同裂酶（isoschizomers)： 指来源不同但识别相同靶序列的核酸内切酶。同裂酶进行同样的切割，产生同样的末端。但有些同裂酶对甲基化位点的敏感性不同。 同尾酶（isocaudamer）： 指来源不同、识别靶序列不同但产生相同的粘性末端的核酸内切酶。利用同尾酶可使切割位点的选择余地更大。;2、ＤＮＡ连接酶（DNA ligase） ;T4噬菌体;电镜下的噬菌体;T4-DNA连接酶： T4-噬菌体 连接温度：不高于粘性末端熔点温度（Tm） ≤15℃： 15℃/6h； 12℃/8h； 8℃/12h； ;连接方式： 相同粘性末端的连接 平头末端的连接 不同粘性末端的连接 人工粘性末端的连接 ;粘端连接;平端连接;同聚物加尾连接;人工接头连接;3、反转录酶（reverse transcriptase） ;4、DNA polI 及Klenow片段 ;作业：