质谱技术的应用简介.docVIP

浙江工商大学 研 究 生 课 程 论 文 论文题目课程名称专业学号指导教师日期 关键词 质谱分析，基因，蛋白质组学定性，蛋白质组学定量 1质谱技术简介 质谱技术(Mass Spectrometry，MS)具有灵敏度、准确度、自动化程度高的特点[1]，能准确测量肽和蛋白质的相对分子质量、氨基酸序列及翻译后修饰，因此成为连接蛋白质与基因的重要技术， 开启了大规模自动化的蛋白质鉴定之门[2]。 1.1 质谱技术 质谱是带电原子、分子或分子碎片按荷质比( 或质量) 的大小顺序排列的图谱。质谱仪是一类能使物质粒子高化成离子并通过适当的电场、磁场将它们按空间位置、时间先后或者轨道稳定与否实现质荷比分离[3]， 并检测强度后进行物质分析的仪器。质谱仪主要由分析系统、电学系统和真空系统组成[4]。 1.2 质谱分析的原理 用于分析的样品分子( 或原子) 在离子源中离化成具有不同质量的单电行分子离子和碎片离子，这些单电荷离子在加速电场中获得相同的动能并形成一束离子，进入由电场和磁场组成的分析器，离子束中速度较慢的离子通过电场后偏转大，速度快的偏转小[5.6];在磁场中离子发生角速度矢量相反的偏转，即速度慢的离子依然偏转大，速度快的偏转小;当两个场的偏转作用彼此补偿时，它们的轨道便相交于一点。与此同时，在磁场中还能发生质量的分离， 这样就使具有同一质荷比而速度不同的离子聚焦在同一点上，不同质荷比的离子聚焦在不同的点上，其焦面接近于平面， 在此处用检测系统进行检测即可得到不同质荷比的谱线，即质谱[7.8]。通过质谱分析，可以获得分析样品的分子量、分子式、分子中同位素构成和分子结构等多方面的信息[9]。 2质谱技术的应用 2.1质谱法对蛋白质组学的定性研究 2.1.1　肽质量指纹法　 基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱测量法，以多肽质量/电荷比为依据同数据库资料进行比较，进而对蛋白质进行鉴定。此法通常被称为肽质量指纹法。肽质量指纹法是在测定前进行透析，有效去除了盐分，可得到满意的样品峰。依靠可靠的数据库检索，仅用少量的肽片段即可鉴定蛋白质[10]。基质辅助激光解吸电离能够耐受少量杂质的存在，对于纯度不是很高的样品也能得到理想的结果。因此，肽质量指纹法被认为是鉴定蛋白质最常用、最快速、最有效的方法[11] 。肽质量指纹法的关键是相对分子质量的精确度，但蛋白质翻译的多种可能性易导致错误鉴定，所以该法通常只能适用于已完成测序、数据库注释详尽的小基因组的生物。但随着搜索数据库算法的增强，肽质量指纹法得到进一步的发( knowledge2based scoring functions)可以快速选择候选评分复杂蛋白质，使鉴定精度大为提高[12，13] 。 2.1.2　色谱与质谱连用　 将色谱技术与新型质谱技术相结合，可有效地克服双向凝胶电泳/质谱的不足，确保了分析的准确性。色谱和质谱连用鉴定蛋白质组技术是由Yates的实验室首先介绍的，先对蛋白质混合物进行酶切得到混合肽段，然后通过强离子交换反相色谱柱进行多次分离，并连用液相色谱-串联质谱分析肽段，而且通过核素标记肽段的技术实现蛋白定量分析[14-17] 。分离后的产品离子得到完好地扫描，连用分析肽段，可以区分待测蛋白质和其他类似物。色谱、质谱连用技术发展迅速，但是由于蛋白质不易完全分离，导致质谱峰重叠，降低了鉴定的准确性。另外，由于蛋白质翻译后修饰，源于相同基因的蛋白质可能迁移至不同位置，也会对鉴定造成困难。一些新的联用方式，如反相色谱与二维凝胶电泳与质谱的联用，强阳离子交换色谱与质谱的联用，以及高效液相色谱与傅立叶变换质量分析器的联用，使情况大为改观。 2.1.3　串联质谱技术　 蛋白质串联质谱鉴定是利用了肽段氨基酸序列的特异性，其鉴定蛋白质的特异性更高，仅一条肽段就可鉴定蛋白质，可用于蛋白质混和物的鉴定。适当调整后，可鉴定蛋白质翻译后修饰，它是目前鉴定蛋白质常用的方法[18] 。大致分为空间串联质谱和时间串联质谱。离子阱质量分析器耦合时间串联质谱，可在同一个质量分析器上完成母离子选择、存储、分裂和检测工作。单一运用空间串联质谱完成同类工作需要几个分析器。相对地，离子阱质量分析器耦合时间串联质谱，可有效地去除其他碎片离子的干扰，适应在复杂背景下分析，具有高离子通量和高效的优点。串联质谱技术要求样品纯化，难于自动化，费时，仪器昂贵，难以操作和维护，所以未能普及至常规实验室。将色谱与串联质谱连用是近年来研究蛋白质组的新方法。反相液相层析质谱配置了涡轮离子喷雾离子源，监测备选离子的三重四极质量分析器，通过多反应监控获取离子方式(正离子) ，敏感、高效地测定了沙海葵毒素[19] 。 2.2　质谱法对蛋白质组学的定量研究 2.2.1　内源标定与液相色谱-串联质