辅助T细胞多巴胺受体（DR）表达对类风湿关节炎（RA）患者疾病活动度的影响.pdfVIP

魏 蕾，等．辅助 T细胞多巴胺受体 (DR)表达对类风湿关节炎 (RA)患者疾病活动度 的影响 145 糖尿病等内分泌系统疾病 ；(3)恶性肿瘤 ；(4)急、慢 (cm)+EGA (cm)L。；SDAI=SJC + TJC+ PGA 性感染 ；(5)近期有明显应激事件发生 ；(6)使用各种 (em)+EGA(cm)+CRP(mg／dL)E73。 可能影响交感神经系统 的药物 ；(7)神经精神障碍 ， 实验方法 包括精神分裂症 、帕金森病、抑郁症等 。同期复旦大 分 离外 周血 单 个 核 细胞 (peripheralblood 学附属中山医院骨科病房接受膝关节置换术的原发 mononuclearcells，PBMCs) 抽取清晨空腹肘静脉 性膝骨关节炎 (osteoarthritis，OA)患者 13名 以及 血 1OmL，EDTA抗凝 ，423Xg离心 10min后上层 健康志愿者 12名为对照，膝骨关节炎诊断符合 血浆冻存于一80℃冰箱保存 ，下层细胞用 Ficoll密 1986年美国风湿病学会公布 的膝骨关节炎修订标 度梯度离心法 800Xg离心 20min分离 PBMC，调 准 。对照均满足排除标准 。 整细胞 终浓度 至 1X10／mL，冻存 于含有 1O 主要试剂 兔抗人 DRD1、D3、D4、D5多克隆 DMSO的FBS冻存液 中，置于程序降温盒于一80℃ 抗 体 (德 国 Merk Millipore公 司)，D2(美 国 保存。 LifeSpanBioSciences公司)。A．PC—H7标记的 CD4 细胞复苏与刺激 冻存管在 37℃水浴 中迅速 (Cod．560158，cloneRPA—T4)、APC标记 的 IFN一 摇晃解冻 ，1～2min融化后 ，423Xg离心 10min，弃 (Cod．551385，clone4S．B3)、PerCP—Cy 5．5标记 上清 ，用含 10 胎牛血清的 1640培养液重悬细胞 ， 的 IL-4 (Cod．561234，clone8D4—8)、PECOnjugated 台盼蓝染色 ，计算细胞存活率 (90 )。调整细胞 IL一17A(Cod．560436，cloneSCPL1362)鼠抗人单克 浓度 (终浓度为 1X10／mL)，接种于 24孔板 中，每 隆(1gG1一K)流式抗 体及其 同型对 照抗体 (美 国 孔加入佛波酯 (50ng／mL)、离子霉素 (1000ng／ BectonDickinson公司)。佛波酯 (phorbolmyristate mL)及阻断剂布雷菲德菌素 A，予 37℃、体积分数 acetate，PMA)、离子霉素 (ionomycin)以及 蛋 白转 为 5 CO：条件下培养 6h。 运抑制剂布雷菲德菌素 A(brefeldinA)、染色缓冲 流式细胞 术检 测 Th1、Th2、Thl7细胞 DR 亚 液以及固定破膜剂 (美 国BectonDickinson公司)。 群 每个样本加入 500 L含有 1 牛血清 白蛋 白 淋 巴细胞分离液 、二 甲亚砜 (DMSO)、CF405M 标 (BSA)的 PBS放置于 4。冰上封闭 30min，423Xg 记羊抗兔抗体、青霉素 、链霉素 (美 国Sigma公司)。 离心 10rain后用 250肚L染色缓冲液混匀 ，制成细 1640培养液 (RPMI一1640)、灭活胎 牛血清 (FBS) 胞悬液 。每管流式细胞管加入 50 L细胞悬液 。细 (美 国 GibcoBre公司)，兔 lgG抗体 (美 国 Santa 胞染色分为 3步 ：第一步加入 APC—H7标记 的CD4 Cruz公 司)。 抗体及分别对应兔抗人DR抗体 D1～D5(1：100稀 临床评估 记录 RA患者、骨 OA患者 以及健 释)，4℃避光孵育 30min，加入染色缓冲液 1mL 康志愿者一般资料 ，RA患者临床评估包括 ：28关节 洗涤后 ，用 90 L染色缓冲液重悬 ，加入 CF405M 关节压痛