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聚合酶链式反应及其在基因诊断中的应用聚合酶链式反应于年由美国公司的发明并和定点突变的发明者一起荣获年度诺贝尔化学奖为生命科学领域的研究开创了崭新时代一反应原理和反应过程的体外复制包括个步骤变性退火延伸个步骤作为的一个循环每当完成一个循环一个分子的模板被复制为二个产物量以指数形式增长二的反应体系和反应条件一反应体系参与反应的主要成份模板引物聚合酶和缓冲液等模板包括基因组质粒线粒体等作为模板时须先将逆转录为再以作为扩增的模板模板量引物扩增产物的特异性和长度是化学合成的寡核苷酸片段引物的合成可以采用化
聚合酶链式反应及其在基因诊断中的应用
聚合酶链式反应于1983年由美国Cetus公司的K.Mullis发明,并和定点突变的发明者M.Smith一起荣获1993年度诺贝尔化学奖,为生命科学领域的研究开创了崭新时代。
一、PCR反应原理和反应过程
DNA的体外复制包括3个步骤:
变性(denaturation):94 (C ~95 (C
退火(annealing):40 (C ~70 (C
延伸(extension):72 (C
3个步骤作为PCR的一个循环,每当完成一个循环,一个分子的模板被复制为二
个,产物量以指数形式增长。
二、PCR的反应体系和反应条件
(一)PCR反应体系
参与PCR反应的主要成份:
模板、引物、dNTP、Taq DNA聚合酶和缓冲液等。
1 模板
包括基因组DNA、RNA、质粒DNA、线粒体DNA等。RNA作为模板时,须先将RNA逆转录为cDNA,再以 cDNA作为扩增的模板。模板量:1000ng、500ng、100ng、50ng(
2、引 物(Primers)
PCR扩增产物的特异性和长度,是化学合成的寡核苷酸片段。引物的
合成可以采用化学方法。引物设计时必须遵循一些原则。
设计引物的原则:
1)二条引物分别位于被扩增片段的两端,与模板正负链序列互补
2)长度为18 ~ 25个核苷酸
3)二条引物之间避免形成引物二聚体
4)引物的碱基组成应平衡
5)引物退火温度计算:Tm=2(A+T)+(C+G)
6)引物的5`端可被修饰(引入酶切位点、引入突变位点、生物素等标记)
3、脱氧核苷三磷酸(dNTP)
是dATP、dCTP、dGTP和dTTP4种脱氧核苷三磷酸的混合物。反应体系中各种核苷酸的浓度必须一致,浓度过高虽能加快反应速度,但非特异性扩增也随之增加
dNTP浓度:20 ~ 200umol/L,浓度升高增加非特异性扩增。
4、DNA聚合酶
从一种生活在热泉(80℃~90℃)中的水栖噬热菌(Thermus aquaticus, Taq)中提取,有很高的耐热稳定性。
Taq 酶的作用:模板指导下,以dNTP为原料,在引物3’-OH末端加上脱氧单核苷酸,形成3’, 5’ -磷酸二酯键,使DNA链沿5’→3’方向延伸,催化DNA合成。
最适酶量:1-2.5U (酶量过多,导致非特异性扩增)
Taq DNA聚合酶复制的保真性,Taq DNA聚合酶无3’→5’外切酶活性,因而无校正功能,在复制新链的过程中会发生碱基错配。Taq DNA聚合酶在每次循环中产生的移码突变率为1/30000,碱基替换率为1/8000,故扩增的片段越长,错配的机率越高。
耐热的 DNA多聚酶有Pwo DNA polymerase、Tth DNA polymerase、Pfu DNA polymerase具有较高的热稳定性,较高的保真性,降低碱基错配率2 ~ 10倍。
5、镁离子浓度
镁离子浓度是一个至为关键的因素,对于反应系统本身、稳定核苷酸和提高Taq 酶的活性有直接影响。虽然Taq 酶的活性只与游离的Mg2+浓度有关,但PCR反应体系中dNTP、引物、模板DNA及鳌合剂的存在均可与Mg2+结合而降低游离Mg2+的浓度从而影响酶的活性。
当dNTP浓度为200umol/L时,MgCl2的浓度为1.5mmol/L较宜。
6、其它反应因素
pH:调节至酶反应所需的最适pH( pH =7.2左右)
盐:合适的盐浓度有利于稳定杂交体,有利于引物与模板杂交
基质:BSA、gelatin 、Tween20、DTT等(牛血清白蛋白或明胶等基质可以保护Taq 酶的活性)
(二)PCR的反应条件
反应温度(变性、退火、延伸)
反应时间(变性、退火、延伸)
循环次数(PCR效率及产物量)
1、温度
变性温度:94 ~ 97 ℃
退火温度:低于引物Tm 5 ℃左右。温度过高会降低扩增效率;温度过低:增
加非特异性扩增。
延伸温度:72度,此时Taq酶具有较高的酶促活性。
2、时间
第一次变性应给予足够时间(5 ~ 7分钟)。每一个步骤所需时间取决于扩增片
段的长度,一般为30秒~ 1分钟,时间过长易导致非特异性扩增
3、循环次数
重复次数一般设为25~35个循环
扩增反应的平台效应:理论上,PCR反应产物呈指数性增长,但这种增长形式在扩增25-25个循环以后便放慢直至停止,达到反应平台,此时扩增产物量不再随循环次数的增加而呈指数增长。
平台出现得迟早与模板的初始量有关,模板初始量越多,平台出现得越早。
平台效应产生的因素:引物二聚体的产生、反应产物、各组分的消耗和变性、引物和已扩增的DNA片段间的竞争等。
三、PCR技术的质量控制
(一)实验室的规范化设置
实验室的规
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