清肺化痰通络方对肺纤维化大鼠基质金属蛋白酶-2、基质金属蛋白酶-9表达影响.docVIP

清肺化痰通络方对肺纤维化大鼠基质金属蛋白酶-2、基质金属蛋白酶-9表达影响[摘要] 目的 探讨清肺化痰通络方对博莱霉素A5（BLMA5）所致肺纤维化大鼠的干预作用及可能机制。 方法 将Wistar大鼠随机分为对照组、模型组、干预组。模型组和干预组通过气管插管灌注BLMA5复制大鼠肺纤维化模型，对照组给予等量生理盐水气管灌注；对照组和模型组给予生理盐水灌胃，干预组给予清肺化痰通络方药物灌胃。灌胃后3、7、14、28 d分别处死大鼠，采用HE和Masson染色观察肺组织病理变化，免疫组化染色检测基质金属蛋白酶-2（MMP-2）、 MMP-9在肺组织的表达水平。 结果 清肺化痰通络方能显著改善大鼠的一般身体状况，减轻肺泡炎及肺纤维化的程度。干预组和模型组肺内MMP-2表达在第14天达到高峰，MMP-9的表达在第7天达到高峰，且两组同时期MMP-2、MMP-9的表达均高于对照组（P ＜ 0.05）；干预组MMP-2、MMP-9表达低于同时期模型组 （P0.01）。 结论 清肺化痰通络方可能通过抑制MMP-2、MMP-9在肺内的表达，对BLMA5致肺组织纤维化起到一定的防治作用。 [关键词] 肺纤维化；基质金属蛋白酶-2；基质金属蛋白酶-9 [中图分类号] R285.5 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2012）05（c）-0014-03 肺纤维化是多种慢性肺疾病的共同结局，表现为肺间质细胞大量增殖、细胞外基质（ECM） 异常增生及肺组织结构的重构，疾病早期表现为弥漫性肺泡炎，肺泡结构破坏，肺泡上皮细胞和基底膜的损伤是肺间质纤维化病理过程的特征性改变，MMP-2和MMP-9可以降解肺泡壁基底膜的重要成分Ⅳ型胶原，因此，MMP-2和MMP-9在肺纤维化的发生过程中起着重要的作用。清肺化痰通络方是全国名老中医邱幸凡教授的临床经验方，在临床应用中取得了较好疗效。本实验借鉴博莱霉素A5（BLMA5）诱发的大鼠肺纤维化模型，利用免疫组化法检测肺内MMP-2和MMP-9的表达，以探讨清肺化痰通络方防治肺纤维化的作用及可能机制。 1 材料与方法 1.1 实验动物 雌性Wistar大鼠72只，SPF级，体重（200±20）g，购于武汉大学试验动物中心。 1.2 试验药物 清肺化痰通络方由黄芩、瓜蒌、桃仁、地龙、黄芪、当归、鱼腥草（购于湖北省中医院）组成；常规水煎后，水浴浓缩药液至每1 mL含生药2 g，4℃保存。将BLMA5（8 mg/支，天津太和制药有限公司，批号：030705）制成5 mg/mL的生理盐水溶液。MMP-2单克隆抗体（产品编号：ZM-0330）、MMP-9单克隆抗体（产品编号：ZM-0335）及Sp试剂盒（产品编号：SP-9000）由北京中杉金桥生物技术有限公司提供。 1.3 肺纤维化模型制作 参照文献[1]，将大鼠麻醉，趁动物吸气瞬间，在额镜的直视下迅速将焊锡制成圆头的12号腰穿针头，通过声带插入气管约3~4 cm，缓慢注入BLMA5生理盐水溶液1 mL/kg。立即将大鼠直立旋转。 1.4 动物分组及处理方法 将72只大鼠随机分为三组：① 模型组（24只）：造模2 h后，生理盐水灌胃，15 mL/（kg·d）；② 干预组（24只）：造模2 h后，清肺化痰通络方水煎剂灌胃，15 mL/（kg·d）；③对照组（24只）：不造模，生理盐水灌胃，15mL/（kg·d），灌胃前禁食4 h，不禁水。以上各组动物分别在实验第3、7、14、28天各处死6只。 1.5 标本采集及处理 经0.5%戊巴比妥钠溶液腹腔内注射麻醉后，称重；颈动脉放血处死，10％甲醛溶液固定右肺上叶，制作石蜡切片，用于HE染色和Masson染色及肺组织MMP-2和MMP-9表达检测。 1.6 指标检测 1.6.1 病理染色分析 依据Szapiel等[2]方法，确定肺泡炎及肺纤维化程度。①肺泡炎分级，0分：无明显病变；1分：轻度肺泡炎，病变占全肺20%以下；2分：中度肺泡炎，病变局限在全肺20%~50%；3分：弥漫性肺泡炎，病变范围超过50%。②肺间质纤维化分级，0分：无肺间质纤维化；1分：轻度肺间质纤维化，病变范围局限在全肺20%以下；2分：中度肺间质纤维化，病变范围占全肺20%~50%；3分：重度肺间质纤维化，病变范围超过50%，肺泡结构消失，肺组织结构紊乱。 1.6.2 免疫组织化学分析 Sp法测定肺组织的MMP-2和MMP-9表达，采用HUMIAS-2000医学图文分析系统，对免疫组织化学结果定量分析。每张切片在高倍视野（×400）下随机选择不相重叠的5个视野，细胞核为蓝色，MMP-2和MMP-9阳性细胞为棕黄色，阴性对照片以PBS替代MMP-2和MMP-9。测定阳性细胞的积分光密