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RAPD分子标记的实验原理及操作流程
RAPD标记原理
RAPD技术的全称是随机扩增多态性DNA(Random Amplified Polymorphic DNA)，此技术建立于PCR基础之上，使用一系列具有10个左右碱基的单链随机引物，对基因组的DNA全部进行PCR扩增，以检测多态性。由于整个基因组存在众多反向重复序列，因此须对每一随机引物单独进行PCR，单一引物与反向重复序列结合，使重复序列之间的区域得以扩增。引物结合位点DNA序列的改变以及两扩增位点之间DNA碱基的缺失、插入或置换均可导致扩增片段数目和长度的差异，经琼脂糖凝胶电泳分离后通过EB染色以检测DNA片段的多态性。
?
一、实验材料
?? 不同来源的DNA(30-50ng/ul)。
二、实验设备
??PCR仪，PCR管或硅化的0.5ml?eppendorf管，电泳装置，凝胶成像仪。
三、试剂
1、RAPD引物：购买成品RAPD引物序列合成。
2、Taq酶
3、10xPCR?缓冲液
4、MgCl2：25mmol/L。
5、dNTP：2.5mmol/L。
四、操作步骤：
? ?1.?在15ul反应体系中，加入
模板DNA?1ul?(30-50ng)
RAPD引物?1ul?(约5pmol)
10xPCR?Buffer?1.5ul
MgCl2??1ul
dNTP??1ul
Taq酶?0.5单位（U）
加ddH2O?至?15ul
?? 混匀稍离心,?加一滴（约20?ul）矿物油。
?? 2.?在PCR仪中预变性94℃?2分钟,?然后循环:?94℃?1分钟，?36℃?1分钟，?72℃?1分钟，共40轮循环。
? ?3.?循环结束后,?72℃?10分钟，4℃保存。
??4.?在15ul?PCR产物中加2ul上样缓冲液(6x)于1.6%?琼脂糖胶上电泳,?稳压50-100Ｖ。?
??5.?电泳结束，溴化乙锭染色20分钟。
6.?用凝胶成像仪观察、拍照。
注：样品可以采用新鲜样品，硅胶干燥样品，标本等
DNA提取可采用CTAB或SDS法?
DNA质量检测可用紫外分光光度计法和电泳法
操作流程简图：
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