加味麦门冬汤对肿瘤化疗药物环磷酰胺增效作用实验探究.doc

加味麦门冬汤对肿瘤化疗药物环磷酰胺增效作用实验探究(浙江中医药大学，浙江杭州310053) 摘要：目的：通过观察加味麦门冬汤(简称M)与环磷酰胺(CTX)联用对S180小鼠血清IL-2水平及肿瘤组织NF-k Bp65表达的影响，探讨加味麦门冬汤对CTX增效作用的机制。方法：复制移植性S180小鼠模型，灌服加味麦门冬汤高、中、低剂量(48、24、12g/kg)并同时腹腔注射CTX(25mg/kg)，用药11天。第12天小鼠眼球取血，处死。剥瘤，称重，计算抑瘤率、增效率，双抗体夹心ELISA法检测血清IL-2含量，免疫组化SABC法检测肿瘤组织中NF-k Bp65的表达。结果：M高、中剂量加CTX组增效率(Q值)均大于0.85，具有增效作用；M高剂量加CTX组小鼠血清IL-2含量与CTX组比较差异有显著性(P＜0.05)；M高剂量加CTX组可明显下调瘤组织中NF-x Bp65的表达(与CTX组比较P＜0.05)。结论：提高血清IL-2含量，增强机体抗瘤能力和下调肿瘤组织中NF-k Bp65的表达，促进瘤细胞调亡可能为加味麦门冬汤对CTX增效作用的机制之一。 关键词：加味麦门冬汤；环磷酰胺；增效 中图分类号：R289.5　文献标识码：A 文章编号：1673-7717(2007)05-1010-03 加味麦门冬汤为麦门冬汤加黄芪而成。麦门冬汤在《金匮要略》中主治“虚热肺痿”，具有清虚热及气阴双补的作用。药理研究表明，黄芪、麦冬、半夏、人参对多种肿瘤细胞有抑制作用。本实验拟从加味麦门冬汤对S180小鼠血清IL-2含量的影响及调节NF-k Bp65在瘤组织中的表达，初步探讨该方对CTX增效作用的机制，为其临床应用提供一定的实验依据。 1实验材料 1.1实验动物　ICR小鼠80只，体重(20±2)g，雌雄各半，购于上海医学科学院实验动物中心。 1.2瘤株　小鼠肉瘤S180，购于上海医学科学院实验动物中心。 1.3实验药品　①加味麦门冬汤：组成与剂量：麦冬70g，半夏10g。人参6g，甘草6g，粳米5g，大枣4枚。生药购自浙江中医学院门诊部中药房，符合国家药典标准(2000年版)，中药汤剂由本院制剂室制备。药物浓度分别为48、24、12g/kg高、中、低3个剂量，分别相当于成人剂量的24、12、6倍。②注射用环磷酰胺(CTX)：0.2/瓶，江苏恒瑞医药股份有限公司。③0.9％氯化钠注射液：250mL/瓶，华裕(无锡)制药有限公司。 1.4试剂与仪器 ①试剂：小鼠IL-2 ELISA试剂盒(FMK0001)购自晶美生物工程(北京)有限公司；RabbitAnti-NF-k Bp65(BA0610)、SABC染色试剂盒及DAB显色试剂盒，购自武汉博士德生物工程有限公司。②仪器：TGL-16B台式高速离心机，PYX-DHS-35 x40隔水式电热恒温培养箱，MK3酶标仪，Leitz1512型组织切片机，O-LYMPUS双目显微镜。 2实验方法 2.1移植性S180动物模型的建立　无菌条件下抽取传代后8天的小鼠肉瘤S180腹水，显微镜下计数，调整细胞数为1×107／mL，台盼兰染色计数活细胞数＞95％。将S180腹水瘤液以0.2mL/只移植于1小鼠右腋皮下，复制S180小鼠模型。 2.2实验步骤　接种瘤株24h后，小鼠随机分为8组，模型组、CTX组、中药高、中、低剂量组，中药高、中、低剂量加CTX组，每组10只，雌雄各半。模型组、CTX组每日灌服0.9％生理盐水，其余组灌服相应剂量的中药，按0.2mL/10g体重计算药量；同时，CTX组及中药3个剂量加CTX组每日腹腔注射CTX0.2mL/只(25mg/kg)，其余组每日腹腔注射0.9％生理盐水0.2mL，连续11天。于实验第12天(停药24h后)，称重，眼眶后静脉丛取血，离心，取血清检测IL-2含量；脱颈椎处死小鼠，取出瘤块，分析天平称重，10％的中性甲醛固定，免疫组织化学检测。 2.3抑瘤率(IR)增效率(Q值计算)观察　按下式计算用药各组抑瘤率及增效率：抑瘤率=(1-用药组平均瘤重/模型组平均瘤重)×100％；增效率q=E180/EA+(1-EA)EB。式中EA为A药抑瘤率，EB为B药抑瘤率，EAB为两药合用的抑瘤率，q=0.85～1.15为两药作用相加，q＞1.15为两药作用增强(或协同)，q＜0.85为两药拮抗。 2.4血清IL-2含量测采用双抗体夹心ELISA法检测，具体操作步骤按试剂盒说明书进行。 2.5肿瘤组织中NF-k Bp65表达测定　制作肿瘤组织石蜡包块，切片(4μm厚度)，免疫组化SABC法染色，染色步骤按试剂盒说明书进行，以PBS代替一抗作为阴性对照。光镜下观察NF-k Bp65标记阳性切