氧化型低密度脂蛋白影响人脐静脉内皮细胞生存率及两种细胞因子分泌.docVIP

氧化型低密度脂蛋白影响人脐静脉内皮细胞生存率及两种细胞因子分泌摘要：目的：研究氧化型低密度脂蛋白对体外培养的人脐静脉内皮细胞的影响及其可能机制。方法：采用人脐静脉内皮细胞原代培养，加氧化低密度脂蛋白(ox－LDL)共同孵育，用MTT法测细胞生存率、ELISA法测白介素(il－6)和单核细胞趋化蛋白－1(NCP－1)，并设空白组进行对照。结果：OX－LDL能造成血管内皮细胞具有某些动脉粥样硬化(AS)特征的改变。如内皮损伤、IL－6、MCP－1水平升高。与对照组相比有显著差异(P0.01)。结论：可用ox－LDL刺激体外培养的内皮细胞来进行动脉粥样硬化的研究。 关键词：氧化低密度脂蛋白；血管内皮细胞；细胞生成率；IL－6；MCP－1 中图分类号：R 33 文献标识码：A　文章编号：1673－7717(2008)01－0100－02 动脉粥样硬化(AS)的主要病理改变为脂质条纹、粥样斑块引起的血管弹性减退，管腔狭窄，以及血脂升高，血液流变学异常等。一般认为是由于血浆中过高的脂质使内皮细胞发生轻度损伤并通过内皮细胞在内皮下沉着。同时单核细胞在内皮黏附，进入内皮间隙并成为含大量脂质的巨噬细胞或称泡沫细胞。进而引起血管平滑肌细胞增殖，基质成分的增生等，从而形成纤维脂质斑块。本研究采用人脐静脉内皮细胞原代培养，加氧化低密度脂蛋白(ox－LDL)共同孵育，检测与AS相关的细胞因子的变化，从而探讨ox－LDL造成血管内皮细胞损伤及其相关机制。 1　实验材料 SD雄性大鼠(清洁级)：由上海中医药大学实验动物中心提供；胎牛血清，胰蛋白酶，胶原酶，M199培养基：Gib－c0公司；曲拉酮－100(Triton x－100)，辣根过氧化物酶(HRP)标记的链霉卵白素：Sigma公司；一抗：Calbiochemis一try Company；二抗：华美公司；DAB试剂盒：普飞公司；四甲基偶氮唑盐(MTr)：Amueroso公司；二甲基亚枫(DMSO)：Amresco；IL－6 ELISA试剂盒：TPI公司；MCP－l ELISA试剂盒：Endogen公司。 2　实验方法 2.1　人脐静脉内皮细胞原代培养　取健康产妇的婴儿脐带(10－20cm)，PBS冲洗，0.1％胶原酶培养液消化。再放人5％C02培养箱。用含20％胎牛血清的M199培养液培养。使用时用0.25％胰蛋白酶消化。 2.2　人脐静脉内皮细胞的鉴定免疫组织化学方法　将细胞用95％乙醇固定，加入3％H2o2消除内源性过氧化物酶。0.5％Triton x－100 PBS增加膜通透性，5％－10％山羊血清封闭所有的抗体，加入l：50倍稀释的免抗入因子相关抗原抗体，加入1：200稀释的生物素标记的二抗，加入1：100稀释的HRP标记的链霉卵白素(strepavidin)，加入DAB液发色，显微镜下观察。用苏木素复染细胞核，冲洗、脱水、封片、照相。可见胞浆内棕色阳性颗粒，胞核呈淡蓝色，说明是血管内皮细胞。 2.3　细胞分组培养的细胞经鉴定为内皮细胞后分为两组，空白对照组(培养的内皮细胞加空白血清)、模型组(培养的内皮细胞加ox－LDL加空白血清)。 2.4　MTr法测细胞生存率　将内皮细胞用0.25％胰蛋白酶消化，以1.6×103／cm浓度取2001uL／孔种值于96孔板，每组8个孔，放人培养箱内培养2.4h。然后按前面分组进行实验。分别于加药45h后取不同的组各加人MTT50ul，再培养4－6h后加入DMSO 200ul，在576nm处用酶标仪测定OD值。 2.5　ELISA法测各组IL－6及MCP－1　采用ELISA法，分别按相应试剂盒操作说明进行。 2.6　统计学处理采用SPSS10.0软件进行单因素方差分析。 3　结果 由表1可见，模型组与空白对照组比OD值降低十分显著(P0.01)，IL－6、MCP－1升高十分显著(P0.01)。 4　讨论 为了研究AS的发病机制，曾建立了许多动物模型，如家兔高脂膳食动物模型等。近年来，细胞病理模型由于克服了整体动物个体差异大，影响因素多.价格贵等不足，更适合于药物筛选及作用机理的分析，故被广泛地应用于AS的研究中。目前常用的细胞病理模型有：联胺诱导内皮脂质过氧化损伤模型、7B－羟基固醇和7－胆固醇诱导内皮细胞凋亡模型、溶血磷脂酰胆碱致内皮细胞损伤模型、ox－LDL致平滑肌源性泡沫模型、xo－LDL诱导人髓系白血病单核细胞株U937泡沫化和凋亡模型、人单核细胞株THP－1细胞等。低密度脂蛋白(LDL)，尤其是氧化低密度脂蛋白(ox－LDL)致AS的作用较明确，故目前大多数研究均采用ox－LDL来造成内皮细胞、平滑肌细胞、单核细胞的AS细胞模型。由于内皮损伤