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病理性瘢痕中结缔组织生长因子免疫电镜观察[摘要]目的：研究结缔组织生长因子(CTGF)在病理性瘢痕组织中的表达定位，以探讨其在病理性瘢痕中的作用及与病理性瘢痕形成的关系。方法：分别留取正常皮肤2例、浅表性瘢痕3例、增生性瘢痕、增生性瘢痕边缘正常皮肤、瘢痕疙瘩及瘢痕疙瘩边缘正常皮肤各5例组织标本，用特异性抗体作为标记物，用胶体金作示踪物进行免疫电镜观察，观察标记物所在位置，以了解在不同组织中表达水平的差异性。结果：CTGF在增生性瘢痕、瘢痕疙瘩、瘢痕疙瘩边缘正常皮肤中的表达均明显高于正常皮肤、浅表性瘢痕及增生性瘢痕边缘正常皮肤。免疫电镜标记显示成纤维细胞细胞超微结构清晰，金颗粒呈团状、点灶状分布，特异性强，CTGF蛋白阳性标记主要位于粗面内质网，粗面内质网核糖体、胶原纤维、细胞外基质、桥粒连接、常染色质等部位也有表达。结论：CTGF与病理性瘢痕的形成有相关性，在其发病过程中可能发挥重要作用。 [关键词]结缔组织生长因子(CTGF)：病理性瘢痕；免疫电镜；胶体金 [中图分类号]R392.11　[文献标识码]A　[文章编号]1008－6455(2007)07－0871－03 临床上常见的病理性瘢痕包括增生性瘢痕和瘢痕疙瘩，是皮肤对创伤、炎症、烧伤应激的一种过度的皮肤纤维增生性疾病，其形成原因至今尚未完全探明。随着研究的深入，人们渐渐认识到结缔组织生长因子(connective tissue growth fac－tor，CTGF)与病理性瘢痕密切相关。阐明CTGF在病理性瘢痕中的表达特点、分布规律、病理性瘢痕中超微结构特点等一系列问题将对最终揭示瘢痕的形成机制等提供科学的依据。本实验通过应用特异性抗体作为标记物，用胶体金作示踪物进行免疫电镜观察，观察标记物所在位置，以分析比较标记物在不同组织中表达水平的差异性，探讨CTGF的表达与病理性瘢痕形成的相关性。 1　材料和方法 1．1　标本来源及实验分组：瘢痕疙瘩的诊断参照1991年James标准，且均属于增生期。病例入选标准还包括：2年内未接受药物注射、放射或外科治疗：1个月内未予任何外用药治疗；无系统疾病者。无局部皮肤病变。标本均来源于潍坊市人民医院美容整形科。总共有标本15例，其中男6例，女9例：年龄18－48岁，平均(30±14)岁；病程1－20年，平均(5.28±4.02)年。瘢痕疙瘩及增生性瘢痕各5例，浅表性瘢痕组3例，正常皮肤对照组2例(均取自健康个体躯干上部)。实验分6组：NS组(正常皮肤组)、SS组(浅表性瘢痕组)、HS组(增生性瘢痕组)、HSN组(增生性瘢痕边缘外正常皮肤组)和K组(瘢痕疙瘩组)、KN组(瘢痕疙瘩边缘外正常皮肤组)。 1．2　主要试剂与仪器：兔抗人CTGF多克隆抗体、即用型SABC免疫组织化学染色试剂盒及DAB显色试剂盒均购自武汉博士德生物工程有限公司。lOnm胶体金标记羊抗兔IgG及山羊血清封闭液购自北京博奥森生物技术公司。电镜为日本产H－7500型透射电镜。 1．3　免疫电镜胶体金标记：取新鲜各组标本各取5例组织，修成lmm3大小，0.25％戊二醛(0.1mol/L，pH7.4二甲砷酸钠缓冲液配制)4℃固定2h，不经锇酸固定，常规脱水Epon812包埋，聚合(37℃：12h，45℃:24h)，70nm超薄切片捞于无支持膜的200目不锈刚网上。①10％H2O2，10mim双蒸水3×2min；TBS(pH7.4，Tris－HCI缓冲液)，3×2min；②1:20的羊血清白蛋白封闭30mim③兔抗人CTGF多克隆抗体，1:50，4℃冰箱过夜；④室温复温1h，pH7.4TBS喷洗，5×3min；pH8.2TBS(含1％BSA)洗，3×2mim⑤10nm金标羊抗兔IgG，室温2h；⑥pH8.2TBS洗，5×3mimpH 7.4TBS洗3×3mim⑦1％戊二醛固定15min，双蒸水洗2次；⑦醋酸双氧铀10min，枸橼酸铅5min，复染。用TBS代替一抗作空白对照，其他步骤相同，透射电镜观察。 2　结果 胶体金标记的阳性信号为电镜下所见的致密、规则、反差比较大的、高电子密度圆形或近圆形颗粒。阴性对照无此颗粒。 电镜下：瘢痕与正常皮肤细胞超微结构清晰，保存良好。瘢痕超微结构显示以成纤维细胞的改变最显著，成纤维细胞数量多、细胞体积大、胞浆丰富，胞浆内有发达的细胞器，主要是大量扩张的粗面内质网。细胞核亦增大，核质丰富，核仁明显。所有6组标本中均出现了胶体金标记CTGF阳性颗粒，金颗粒呈圆形，电子密度高而清晰。在表达定量指标上，与免疫组化中的表达结果基本一致(另文发表)。在表达定位指标上有所区别，在正常皮肤和浅表性瘢痕、增生性瘢痕边缘正常皮肤组织中金颗粒表达较少，金颗粒呈点灶状分布。在正常皮肤主要位于基底细胞中的