肾病Ⅰ号方对大鼠系膜细胞增殖及CTGF COL- Ⅳ表达影响.docVIP

肾病Ⅰ号方对大鼠系膜细胞增殖及CTGF COL- Ⅳ表达影响收稿日期:2009-11-24 基金项目:温州市科技计划项目() 作者简介:胡振奋(1984-),男,浙江温州人,硕士研究生,研究方向:肾脏病的中西医结合治疗。 通讯作者:程锦国(1963-),男,浙江温州人,主任中医师,硕士研究生导师,研究方向:肾脏病的中西医结合治疗。 摘 要:目的:观察肾病Ⅰ号方(SBYHF)对体外培养的大鼠肾小球系膜细胞(glomerular mesangial cell, GMC)的增殖及表达IV型胶原(COL-Ⅳ)及结缔组织生长因子(CTGF)的影响,探讨其抗肾纤维化的机制。方法:通过体外培养GMC技术及体外药物血清实验方法 ,采用CCK-8法检测GMC的增殖,ELISA法检测COL-Ⅳ的分泌水平,RT-PCR法检测CTGFmRNA的表达。结果:肾病Ⅰ号方可显著抑制GMC的增殖(P 1.2.4ELISA法测细胞上清液中COL-IV含量 采集以上各组培养上清液,离心后取上清液于-80℃冰箱保存。按ELISA试剂盒说明书的步骤进行操作,测定标准品及样品的吸光度(OD)值,然后以标准品浓度为横坐标,OD值为纵坐标,绘制标准曲线。根据样品OD值在标准曲线上计算出样品中FN蛋白的含量。 1.2.5 实时荧光定量PCR法检测CTGF mRNA表达 药物处理同上,抽提细胞总RNA,以AMV第一链cDNA合成试剂盒逆转录为cDNA。上下游引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。目的基因CTGF引物序列:上游引物:5’-TAG CAA GAG CTG GGT GTG TG -3’;下游引物:5’- TTC ACT TGC CAC AAG CTG TC-3’。内参基因GAPDH引物序列:上游引物:5’- AGA CAG CCG CAT CTT CTT GT-3’;下游引物:5’- CTT GCC GTG GGT AGA GTC AT-3’。CTGF基因扩增片段长度为156bp,GAPDH基因扩增片段长度为207 bp。参照试剂盒说明书,总反应体系为25μL,实时定量PCR反应在Cotbett Roto-Gene 3000实时定量PCR仪中进行。PCR程序: 95℃ 90s变性,然后 95℃ 5s,58℃ 30s重复 40个循环进行扩增;设定熔解曲线程序:95℃ 1min,58℃ 1min, 58℃ 10s,从 58℃缓慢升温95℃,每升高 0.5℃检测一次荧光信号值。反应结束仪器自动生成CT(threshold cycles)值及熔解曲线图(图1)。每个样本设 2个重复管。采用实时荧光定量PCR相对定量分析方法:2-△△Ct法进行分析。△△Ct = ( Ct目的基因-Ct管家基因 )实验组-( Ct目的基因 -Ct管家基因)对照组,本实验以正常组为对照组,其余各组 mRNA的相对表达量用对照组的 2 -△△ Ct倍表示。 图1 熔解曲线图 1.3统计学方法? 采用SPSS 13.0 for Windows统计软件进行统计分析,多组间比较采用单因素方差分析,组间比较采用多样本均数间两两比较的 LSD法,计量资料数据用?±s?表示。相关指标做线性相关分析。 2 结果与分析 2.1 肾病Ⅰ号方对大鼠系膜细胞增殖的影响 ? 与正常对照组比较,肾病Ⅰ号方各剂量组和洛汀新组均能显著抑制系膜细胞的增殖(P0.05)。与肾病Ⅰ号方低剂量组比较,肾病Ⅰ号方各剂量组间呈现出一定的浓度依赖和时间依赖的特点,见表 2。 表1 各组细胞增殖情况(±s) 组别nOD值 24h48h 抑制率(%) 24h48h 正常对照组60.6745±0.17922.3699±0.284-- SBYHF低剂量组60.5599±0.1184?*1.6103±0.4195?*16.9932.05 SBYHF中剂量组60.4171±0.1027*#0.8071±0.211*#38.1665.95 SBYHF高剂量组60.365±0.0785*#※0.7677±0.1949*#45.8967.61 洛汀新组60.4478±0.0633*#0.8989±0.1583*#33.6162.07 注:与正常对照组比较,*P0.05),肾病Ⅰ号方高剂量组降低CTGF基因表达有显著差异(P 肾小球系膜细胞过度增殖引起ECM合成的增加,进而导致 ECM在肾小球内的蓄积,是肾纤维化进程中的重要环节[4]。ECM积聚和沉积是肾脏纤维化的主要特征性改变。因此,通过调控细胞因子的表达,抑制MC增殖,减少ECM的生成,在拮抗肾纤维化,延缓