肾综合征出血热患者血清标本RT―PCR检测方法.docVIP

肾综合征出血热患者血清标本RT―PCR检测方法【摘要】目的应用逆转聚合酶链反应方法(RT-PCR)对临床确诊及拟确诊为肾综合征出血热(HFRS)病例的血清标本进行检测。为临床确诊病例提供一种新的检测手段。方法对临床确诊及拟确诊为HFRS病例的89名患者(男67例，女22例)的血清标本，用RT-PCR方法进行检测。同时对30名健康成年人，标准病毒株，标准阳性血清，标准阴性血清，用RT-PCR方法进行检测。结果紫外线灯观察结果，临床确诊和拟确诊为HFRS病例的89人中，有73人的血清标本在237bp处呈现橙黄色带，为阳性。阳性率为82.02％，标准病毒株，阳性标准血清，在237bp处呈现橙黄色带，为阳性。健康人，阴性血清在237bp处未见橙黄色带，为阴性。结论RT-PCR方法，从分子生物学角度为HFRS的临床诊断提供了一种新的检测手段。该检测方法具有灵敏度高。特异性高，方法简便快捷，适用于临床。 【关键词】逆转聚合酶链反应；肾综合征出血热 【中图分类号】R692 【文献标识码】A 【文章编号】1005-0515f2010)2-047-02 肾综合征出血热(hemorrhagic fever with renalsyndrome HFRS)是由病毒(hantaan virus Hv)引起的一种自然疫源性疾病，HFRS现在仍为国家重点防治的烈性传染病之一。临床上以发热、休克、充血、出血和急性肾功能衰竭为主要表现，若诊断治疗不及时，其病死率可高达30％。我国是受HFRS危害最为严重国家之一。年报告发病人数约4-6万人，占世界报告病例总数的90％以上。由此，我们应用逆转录聚合酶链反映(RT-PCR)检测方法，对临床确诊或拟确诊为HFRS病例的血清标本进行检测。以便为HFRS的早期发现、早期诊断、早期报告、早期隔离、早期治疗提供科学的依据。 1　资料与方法 1.1　研究对象：医院已确诊或拟诊断HFRS的病例89名，其中男性67例，女性22例，病例年龄最大为57岁。最小年龄18岁。患者入院第二天，采集5.0ml静脉血，分离血清，置于-20℃冰箱内保存。另选取30名健康成年人，男女各半，采集5.0ml静脉血，分离血清，置于-20℃冰箱内保存。 1.2 试剂制备 1.2.1　引物设计：据引物设计原则选样18bp,G+C比例为49.79％。(要求为15-30bp，G+C比例为40％～60％)，并以高度保存为行列引物。为增加其保守性。据hantaam病毒基因组中片断(M.RNA)3一OH端18个核苷酸残基在HFRS大、中、小基因片断的高度保守性。同时参考I型代表株76-118株和Ⅱ型代表R22核苷酸行列。设计为3末端起始的18个碱基互补引物对，两引物间距离237bp，以此作为HFRS病毒基因扩增引物。 1.2.2　引物合成：采用DNA自动合成仪合成。 1.2.3　标准病毒株：由沈阳军事研究所病毒室协助提供 1.2.4　其他试剂：反转录酶(AMVRT)TaqDNA聚合酶，缓冲液，样品裂解液，4moL／L异硫氰酸胍0.5Sareosi／L、20mmoL／L柠檬酸钠(PH：7.0)。 1.3　检测方法 1，3，1　标本处理：分别取病例血清、健康人血清，阳性对照血清。阴性对照血清各40ul，加入100ul裂解液，酚，氯仿提取液80ul，稍用力反复振摇30秒，静置5分钟后离心，吸取上清液80ul。加入300ul(-20℃)的无水乙醇，混匀后在20cC下放置1小时后离心(15000转／分)5分钟，弃上清液后备用。 1，3，2　标本检测：RT-Taq酶链反应液稀释后充分混匀，抽取20ul加入上述标本及标准病毒血清中，充分混匀，然后在各反应管中加入1滴消毒石蜡油，离心30秒后，置于40℃反应40分钟，转入94℃预变性5分钟，在经94℃30秒，55℃30秒，72℃60秒扩增30个循环，经72℃延伸5分钟备用，将引物lul／人次，加入反应液中全部转入Taq酶中，充分混匀后离心30秒。按每管19ul分装，在各相应管中加入2ml上述DNA产物，将反应管充分混匀并加入一滴消毒石蜡油，离心20秒，置94℃30秒，55℃30秒，72℃60秒。扩增30个循环。再经72℃延伸5分钟备用。 2　结果 取15ul反应液，经2％琼脂糖凝胶电泳30分钟(SWcm)，在紫外灯下观察结果，对89例临床确诊和拟诊断为HFRS的病例进行检测，其中73例在237bp处出现橙黄色带，为阳性。阳性率为82℃02％，标准病毒株。阳性对照血清，在紫外灯下观察，均在237bp处出现橙黄色带。为阳性。健康人、阴性对照血清，在紫外线灯下观察，在237bp处未见到橙黄色带为阴性。 3　讨论 我们用RT-PCR检测方法