角质形成细胞源IL-1α对成纤维细胞增殖及胶原分泌影响.docVIP

角质形成细胞源IL-1α对成纤维细胞增殖及胶原分泌影响[摘要]目的：研究角质形成细胞分泌的IL-1α对成纤维细胞生物学行为的影响。方法：组织块法培养成纤维细胞，消化法培养角质形成细胞，采用免疫组化方法检测角质形成细胞分泌的IL-1α；成纤维细胞中加入含不同浓度IL-1α抗体(0．04μg／ml，0．2μg／ml，1μg／ml)的角质形成细胞条件培养液为实验组，含DMEM的条件培养液为对照组，采用Cell counting kit-8、放免法测定成纤维细胞增殖、胶原合成。结果：细胞爬片可见大量染色阳性角质形成细胞，细胞增殖测定，各实验组吸光度(A)值与对照组比较，差异均有统计学意义(ρ＜0．01)；随抗体浓度增高，A值减小，0．2μg／ml及1μg／ml浓度组与0．04μg／ml浓度组比较，差异有统计学意义(ρ＜0．01)；胶原分泌浓度测定，各实验组与对照组比较，差异均有统计学意义(ρ＜0．01)；随抗体浓度及胶原浓度增高，0．2μg／ml及1μg／ml浓度组与0．04μg／ml浓度组比较，差异有统计学意义(ρ＜0．01)。结论：正常角质形成细胞分泌大量IL-1α，可促进成纤维细胞增殖，抑制胶原分泌。 [关键词]角质形成细胞；IL-1α；成纤维细胞；细胞增殖；胶原分泌 [中图分类号]R329．2+8 [文献标识码]A[文章编号]1008―6455(2006)12-1337-02 基金项目：国家自然科学基金资助(编号 通讯作者：郭树忠，教授，主任医师，博士研究生导师，科主任； E-mail：shuzhong@fmmu．edu．cn 角质形成细胞能够促进成纤维细胞增殖并抑制其胶原合成，这种作用是由角质形成细胞分泌的各种活性因子来实现的。但角质形成细胞分泌的每一种因子对成纤维细胞到底有什么具体作用，现在研究的还不是很清楚。IL-1α是角质形成细胞分泌的重要因子，可调节成纤维细胞大量基因的表达，影响多种生物活性因子合成与分泌，也是角质形成细胞-成纤维细胞相互作用环路中的一个主要因子。但其对成纤维细胞的具体作用仍不明确，故我们对其进行了研究。 1　资料和方法 1．1材料：无血清角质形成细胞培养基(Keratinocyte-SFM，KSFM，Gibco公司，美国)，DispaseⅡ酶(Gibco公司，美国)，DMEM(Dulbecco’s Modified Eagle Medium，DMEM，Gibco公司，美国)，小牛血清(杭州四季青生物工程材料研究所)，人Ⅲ型前胶原(PCⅢ)放免试剂盒(海研所)，Cell countingkit-8(CCK-8，Dojindo，日本)，IL-1α抗体(RD公司，美国)，生物素化兔抗山羊IgG和ABC复合物(Vector公司，美国)。 1．2细胞培养 1．2．1角质形成细胞培养：选用正常小儿包皮组织(来自包皮环切术)，按常规角质形成细胞培养方法培养正常的角质形成细胞。细胞融合达80％～90％时换为无生长因子的角质形成细胞专用培养基，48h后收集上清，-70℃保存备用。用前以DMEM稀释配制成50％的浓度。 1．2．2皮肤成纤维细胞培养：用组织块法进行原代培养，常规消化、传代，实验选用第2～10代细胞。新生牛血清浓度为10％。 1．3方法 1．3．1角质形成细胞源IL-1α测定：采用免疫组化方法。将盖玻片置于6孔板中，加入角质形成细胞(二代)。当细胞爬片融合近80％时取出，0．01mol／L磷酸盐缓冲液(Phosphate-buffed saline,PBS)浸洗5min×3次，4％多聚甲醛固定15min；再次PBS浸洗5rain×3次，山羊抗IL-1抗体(1u／ml)孵育切片，室温下24h，后用PBS再浸洗5min×3次；生物素化的兔抗山羊IgG(1：400)孵育切片，室温下4h，PBS浸洗5min×3次；生物素-卵白素-辣根过氧化物酶复合物(ABC复合物，1：500)孵育切片，室温2h。苏木精染液行细胞核衬染，中性树胶封片，光镜下观察。阴性对照：一抗用牛血清白蛋白稀释液替代。 1．3．2 IL-1α对成纤维细胞增殖作用测定：采用CCK-8试剂盒。取对数生长期的成纤维细胞。胰酶消化，含10％小牛血清的DMEM调整细胞浓度为5×104／ml,每孔200μl接种于96孔中，过夜后弃去上清，每孔加入DMEM培养24h，细胞处于70％～80％融合状态，弃上清，再加入不同浓度条件培养液(conditioned media，CM)180μl(90μl50％浓度上清液+90μl含不同浓度抗体PBS)，共5组，每组重复6孔，继续培养24h后加入CCK-8 10μl，2～3h后在450nm处测吸光度A值。 1．3．