酵母多糖提取、组分研究及对小鼠免疫功能影响.docVIP

酵母多糖提取、组分研究及对小鼠免疫功能影响摘要：目的研究啤酒废酵母多糖对小鼠免疫功能的影响。方法以啤酒废酵母为材料，用柠檬酸法提取酵母多糖，苯酚?硫酸法测定多糖含量，纸层析鉴定多糖组分。随机将18月龄的雄性小鼠分为2组，一组每天定时灌胃1％多糖1.0mL，一组灌胃等量生理盐水，连续30d。结果2组小鼠的碳颗粒校正廓清指数、肝脏和脾脏指数以及组织匀浆中超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)活性和丙二醛(MDA)含量有显著差异。结论酵母多糖可促进小鼠免疫器官生长，增强小鼠巨噬细胞的吞噬能力；可显著提高SOD、CAT活性，减少肝脏、脾脏中MDA的含量。 关键词：酵母；多糖；小鼠；免疫功能 中图分类号：Q539文献标识码：A文章编号：1672?979X(2009)07?0026?03 酵母细胞壁由85％～90％碳水化合物及10％～15％蛋白质组成，约一半的碳水化合物为葡聚糖和甘露聚糖[1]。动物实验证明，小鼠服用酵母多糖可增加腹腔巨噬细胞数量，提高酸性磷酸酶的活性，增强机体的细胞免疫和体液免疫，是一种有开发价值的功能性食品营养因子[2，3]。酵母葡聚糖还有膳食纤维的作用[4]，其应用前景使人们看好啤酒废酵母的价值[5?7]。我们通过提取酵母多糖、测定多糖含量、鉴定多糖组分，观察小鼠免疫脏器组织超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)活性和丙二醛(MDA)含量的变化，探讨了酵母多糖对小鼠免疫功能的影响。 1仪器与材料 UV?260紫外分光光度计(日本岛津)；LG10?2.4A高速离心机(北京医用离心机厂)；啤酒废酵母(济南市啤酒集团)；SOD、CAT、MDA试剂盒(南京建成生物工程研究所)；小鼠(山东省医学科学院实验动物中心)∶18月龄的衰老小鼠和3月龄的年轻小鼠；展层剂：正丁醇∶冰醋酸∶水(4∶1∶5)；显色剂∶二苯胺2g，苯胺2mL，85％磷酸10mL，浓盐酸lmL，丙酮100mL。 2实验方法 2.1酵母多糖的提取 取啤酒酵母泥10g，用适量0.9％氯化钠无菌溶液处理，置于离心管，3000r/min离心20min，沉淀用4倍体积pH7.2的0.02mol/L柠檬酸缓冲液重悬。50℃水浴放置4h。冷却后，3000r/min离心20min，冷却至4℃。加入3倍体积的冷甲醇，出现乳白色沉淀，4℃放置过夜。3000r/min离心20min，白色沉淀加入3倍体积乙醇，3000r/min离心20min。收集多糖沉淀，干燥，称重，4℃保存备用[8]。 2.2酵母多糖含量测定 用苯酚?硫酸法[8]。绘制葡萄糖标准曲线，得回归方程：A=0.0046C-0.0606，r=0.9987。取适量酵母多糖配成1％溶液，吸取样品液50μL，在490nm处测吸光度(A)。 2.3多糖组成分析 2.3.1样品处理20mg酵母多糖加1mol/L硫酸2mL，100℃封管水解5h，加入3.7mgBa(OH)28H2O中和硫酸，过滤，收集滤液。 2.3.2标准溶液配制葡萄糖、甘露糖各2.0g分别溶解于100mL水，即为20μg/μL样品。 2.3.3层析取5×14cm滤纸，依次点样，点样量20μL，放入层析缸，当前沿离原点10cm时停止，85℃恒温箱显色10min[9]。 2.4[HTK]多糖对小鼠免疫功能的影响 随机将20只18月龄的雄性小鼠分为2组，每组10只，称体重。第1组为生理盐水组，每天灌胃生理盐水1.0mL；第2组为酵母多糖组，每日1次灌胃1％多糖悬浊液1.0mL，连续30d。测定各项免疫指标[10，11]。 2.4.1免疫器官重量观察2组动物于末次给药后24h取肝脏、脾脏，用滤纸吸干水分后称重，同时取年轻小鼠脏器称重，计算脏器指数。 脏器指数=脏器重量(mg)/体重(g) 2.4.2碳颗粒校正廓清指数观察末次给药24h后，鼠尾静脉注射墨汁10mL/kg(用生理盐水稀释10倍)。注射后2，10min分别从眼眶取血20μL，溶于4mL0.1％碳酸氢钠溶液中，于680nm处测吸光度值(A2，A10)，按下式计算廓清指数k及校正廓清指数α。 k=(lgA2－lgA10)/(t10－t2) α=(k)l/3×体重/(肝重+脾重) 2.4.3SOD、CAT活性和MDA含量测定[12?14]测定活性前先测定组织匀浆的蛋白质浓度，绘制蛋白质标准曲线。取6支洁净试管，准确吸取组织匀浆0.1mL，加入考马斯亮蓝G2503.0mL，充分振荡混匀，放置5min，于595nm处测吸光度值。 蛋白质含量回归方程A=0.0041C?0.0046，r=0.9966 组织匀浆中SOD活性=(A对照管－A测定管)/50％×反应液总体积/