黄杆菌肝素酶Ⅱ克隆及表达.docVIP

黄杆菌肝素酶Ⅱ克隆及表达摘要：目的克隆并表达黄杆菌肝素酶Ⅱ（HepⅡ）的基因。方法通过PCR从黄杆菌基因组DNA中扩增出黄杆菌HepⅡ的基因，经验证后插入到表达质粒pET-28a上构建表达载体，重组质粒转化E.coli BL21(DE3)进行蛋白质表达。结果成功地将PCR扩增得到的测序正确的HepⅡ基因构建入pET-28a载体上，重组质粒转入E.coli BL21(DE3)后表达产物经SDS凝胶电泳鉴定得到目的蛋白，测活显示重组HepⅡ具有活性。结论克隆并成功表达了黄杆菌HepⅡ基因。 关键词：肝素酶Ⅱ；克隆；表达；酶活性 中图分类号：Q55文献标识码：A文章编号：1672-979X(2007)03-0001-04 Cloning and Expression of Flavobacteriun heparinum HeparinaseⅡ FU Wen-bing，YU Xiao， ZHAO Jian*，FAN Li-qiang， LI Su-xia，YUAN Qin-sheng (State Key Laboratory of Bioreactor Engineering, East China University of Science and Technology, Shanghai 200237, China) Abstract：Objective To clone and express the heparinaseⅡgene from Flavobacterium heparinum.Methods The heparinaseⅡ gene was amplified with PCR from the genomic DNA of Flavobacterium heparinum, and it was linked into expression plasmid pET-28a after sequencing, then the recombined plasmid was expressed in E.coli BL21 (DE3). Results The recombined pET-28a with the PCR product of heparinaseⅡ which was confirmed by DNA sequencing was successfully constructed. The expression product of the recombined plasmid pET-28a in E.coli BL21 (DE3) was tested by SDSelectrophoresis. The enzyme activity of the recombined heparinaseⅡ was verified. ConclusionThe heparinaseⅡ gene from Flavobacterium heparinum has been cloned and expressed successfully. Key words：heparinaseⅡ; cloning; expression; enzyme activity 硫酸乙酰肝素蛋白聚糖是一种结构复杂的酸性蛋白聚糖，参与体内一系列的生理和病理过程，如胚胎发育、神经突生长、血管形成、组织修复、炎症、自身免疫、肿瘤生长和转移等[1-3]。硫酸乙酰肝素的酶解是其发挥上述作用的主要因素。酶解后可以释放并激活各种与它结合的活性分子，从而影响各种生理及病理过程。因此，降解硫酸乙酰肝素的酶是至关重要的调节因子，研究该酶具有重要的理论意义和应用价值。 乙酰肝素酶主要从为数不多的一些可以利用肝素为碳源的细菌中分离得到。研究最多的是黄杆菌属的肝素黄杆菌（Flavobacterium heparinum），这是一种革兰阴性菌，最初自土壤分离。在含肝素的培养基中培养肝素黄杆菌时，菌体内会合成降解肝素和乙酰肝素的酶类，目前已分离到3种不同的酶[2, 3]，其中HepⅡ既能作用于肝素也能作用于乙酰肝素。HepⅡ的基因序列全长2 319 bp，1~73 bp为信号肽序列，在1 244位有一个Bgl Ⅱ酶切位点，无信号肽的酶相对分子质量大小为8.4×104。 目前对乙酰肝素酶的研究受限于没有足够数量及一定纯度的酶，此外，细胞中降解其他多糖（如硫酸软骨素）的酶也会对乙酰肝素酶的底物特异性和酶反应效率有一定的干扰。为了解决这些问题并进一步探讨乙酰肝素酶的性质，我们对HepⅡ进行了克隆和表达。 1 材料 肝素黄杆菌、表达质粒载体pET28a(+)、受体菌E.coli JM8