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基因操作设计报告 题目：黑曲霉木聚糖酶基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达 黑曲霉木聚糖酶基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达 郭玉婉（s100201007）韩雅宁（s100201008）胡菲菲（s100201009） 摘要：本文将来源于黑曲霉（Aspergillus niger）的xyn6基因克隆到pET-28a(+)载体上，再转入表达宿主E. coli BL21(DE3)中，获得重组工程菌。IPTG诱导后， xyn6 基因高效表达，得到木聚糖酶。 关键词：木聚糖酶；xyn6基因；大肠杆菌；基因表达 前言 木聚糖是由吡喃木糖通过β-1,4糖苷键连接而成的多聚糖，是半纤维素的主要成份，广泛存在于植物细胞壁中，是自然界中含量仅次于纤维素的可再生资源[1]。木聚糖酶 ( β-1 ,4-xylanase)包括外切木聚糖酶( EC 3. 2. 1. 7) 和内切木聚糖酶 ( EC3. 2. 1. 8)两大类，内切木聚糖酶是指通过内切方式专一降解不同结构的木聚糖的一组酶的总称。它水解木聚糖分子中的β-1 ,4木糖苷键，其水解产物以木寡糖和木二糖为主，还有少部分木糖[2]。木聚糖酶在饲料工业、造纸工业、食品工业以及能源等领域具有很大的应用潜力和价值[3]。目前，已有一百多种木聚糖酶被发现，来源包括细菌、真菌以及酵母等数十种微生物。这些木聚糖酶基因大都表达在大肠杆菌或毕赤酵母等宿主中[4]。一般都是以传统的方法：提取染色体法制备感受态细胞或电转化法转化受体细胞大肠杆菌，从转化子中筛选出阳性克隆。 目前生产应用中的木聚糖酶主要来源于真菌，因为真菌产生的木聚糖酶能够分泌到培养基中，易于纯化分离[5]。黑曲霉(Aspergillus niger)来源的木聚糖酶具有良好的耐酸性，适宜用作动物饲料的添加剂，以降低动物肠道内食糜粘度，消除木聚糖引起的抗营养作用,提高饲料的利用率，促进畜禽健康，减少动物粪便对环境的污染等[6]。 本研究从黑曲霉(A.niger)F19中克隆得到木聚糖酶xyn6基因。将其构建到 Escherichia coli表达载体pET-28a (+)上，并转化E.coli BL21，获得重组工程菌，使黑曲霉木聚糖酶基因xyn6在E.coli内获得高效表达，同时对该重组蛋白进行了酶学分析，为木聚糖酶在工业上的应用奠定基础。 1 材料和方法 1.1 菌株和质粒 本研究所用的菌株和质粒列于表1-1中。大肠杆菌的培养基为LB培养基（0.5% 酵母膏，1% 蛋白胨，1% NaCl，固体培养基中加入1.8% 琼脂），培养温度为37℃。黑曲霉的培养基为马铃薯葡萄糖培养基（5% 玉米粉，1% NaNO3，0.05% KH2PO4，0.05% MgSO4﹒7H2O），培养温度为28℃。抗性菌株培养时抗生素的浓度分别为：氨苄青霉素100ug/mL，卡那霉素30ug/mL。 表1-1 菌株和质粒 Table 1-1. Strains and plasmids used in this study Strains or Plasmids Genotype Sources Strains Aspergillus niger Wild type Laboratory strain E. coli JM109 E.coli el4-(McrA-) recA1 endA1 gyrA96 thi-1 hsdR17 supE44 relA1 Δ（lac-proAB）[F- traD36 proAB- lacIqZΔM15] Laboratory strain E. coli BL21(DE3) E.coli F– ompT gal dcm lon hsdSB(rB- mB-) λ(DE3 [lacI lacUV5-T7 gene 1 ind1 sam7 nin5]) Laboratory strain Plasmids pMD18-T T/A cloning vector; Ampr Takara pET-28a(+) PT7-based expression vector; introduces RGS(H)6 sequence at the each termini of expression proteins; Kanr Novagen pMD18-T-xyn6 pMD18-T harboring xyn6 This study pET-28a-xyn6 pET-28a harboring xyn6 This study 1.2 实验方法 1.2.1 Aspergillus niger 总RNA 离心收集过夜培养的细胞，倾去细胞液，向沉淀中加入适量的RNAiso plus，混匀，室温静置5分钟，然后，4℃ ，12000rpm离心5分钟，将上层水相转移至一Epp