双功能试剂与螯合金属元素标记多肽新技术的建立.pdfVIP

第44 卷 分析化学 (FENXI HUAXUE) 研究报告 第7 期 Chinese Joumal of Analytical Chemistry 1022 -1028 2016 年7 月 IHlI: 10.11895/j.~.02S3-3820.150615 双功能试剂与整合金属元素标记多肤新技术的建立 田慧芳1 徐庆春2 丁慧荣1 田志华l 张宏1 朱华3 王昕4 沈靖*1 1(北京大学肿瘤医院暨北京市肿瘤防治研究所中心实验室， 恶性肿瘤发病机制及转化研究教育部重点实验室，北京 1∞142) 2( 北京中海康医药科技发展有限公司，北京 1 00(82) 3( 北京大学肿瘤医院暨北京市肿瘤防治研究所核医学科，北京 1∞142) 4( 中国人民解放军防化学院生化防护系，北京 102205) 摘要建立了双功能试剂 2-[ (4-异硫氨基苯基)甲基]-1 ,4 , 7 , 10-四氮杂环十二烧-1 ， 4 ， 7 ， 10-四乙酸 (p-SCN-Bn-DOTA) 与标准肤段反应的新方法，测定了反应产物与钢系金属 Eu侧的整合效率，探索了其作为靶 向探针和蛋白定量标记试剂性能。考察了不同缓冲体系的浓度及 pH 值、p-SCN-Bn-DOTA 量与肤段相对量、 反应体系中有机相与水相比例，反应温度与反应时间对偶联效率的影响。实验结果显示: p-SCN-Bn-DOTA 量 为肤段的 32 倍，缓冲体系为0.2 mo l/L TEAB (pH 8.5) ， ω℃反应ωmin，有机相与水相之比为4.4: 1(V/V) 时标记效率高;在 HCl/NaAc 缓冲体系(pH4.0) 中 ω℃反应60 min ，金属离子整合反应效率高达94% 。本研 究建立了一种新的基于双功能试剂p-SCN-Bn-DOTA 的标记方法，并成功用于 RGD 肤等的标记。 关键词 双功能试剂;标记;多肤;蛋白定量;质谱 1 51 双功能试剂连接多肤并整合金属元素，可以作为靶向探针结合分子影像技术用于肿瘤的靶向治疗 研究[1] ，还可以通过标记多种金属元素制备蛋白质组学多重定量试剂[2] ，用于肿瘤标志物的筛选、鉴 定、分类等研究。因此双功能试剂在肿瘤研究方面具有良好的应用前景。 RGD 肤是一类含有精氨酸·甘氨酸-天冬氨酸(Arg-Gly-Asp) 序列的短肤，基于靶向多肤 RGD 进行 放射性核素标记可用于 α，ß3(+) 肿瘤的无创性检查以及判断患者是否适用于抗肿瘤血管形成治 疗[3 刑。此外，标记的小分子多肤具有生物相容性好、穿透性强、免疫原性低、作用快、易于实时监测的 特点，可在基于靶向探针的蛋白的分析检测方面发挥独特优势[町]。 在肿瘤蛋白质组定量分析研究方面，目前已开发的方法有基于稳定同位素标记的方法，如 18 ICAT[8] 、 0 酶切标记[圳、SILAC[叫、iTRAQ[II] 等，但这些方法普遍存在同位素价格昂贵、标记难度较大、 对质谱分析仪器具有选择性、同位素峰在质谱分析时会发生相互干扰等缺点，会给定量结果带来误 差口2] 。因此探索非同位素标记的方法，开发具有我国自主知识产权的蛋白定量试剂具有重要意义。文 献[13 -15 J 报道了针对肤段半眈氨酸标记设计的金属编码亲和标签。徐明等问]利用外源 Hg 标签标 记晒蛋白/多肤，实现 Se-Hg 双元素标记选择性识别和检测晒蛋白/多肤。但是在实际的蛋白质组学样 本分析中，需要使用适用于所有肤段的标记方法。 Liu 等[口]开发了基于双功能试剂二乙酸胶五乙酸的 标记方法，实现了肤段的无歧视标记，但所选择的双功能试剂标记效率不高。针对此问题，Wang 等[叫 用是基玻咱酷亚胶·四氮杂环十二烧四乙酸(DOTA-NHS-ester) 作为整合试剂进行了初步研究，在此基 础上，文献[ 12 ， 19J 对标记方法进行了优化，提高了金属标记效率。