ITS序列分析法鉴定烟草病株分离出两种真菌.docVIP

ITS序列分析法鉴定烟草病株分离出两种真菌 　烟草作为一种重要的经济作物，在我国的种植面积和产量均居世界前列，但每年烟草病害的发生比较严重，给烟农和国家经济带来巨大损失。我国烟草种植区域广，病害种类、分布和危害情况因不同地域而有很大差异，全国 16个主产烟省（区）烟草侵染性病害有62种，其中真菌性病害30种[1]。福建省是我国烟草主产区，烟草侵染性病害发生种类有31种[2]，主要为烟草炭疽病、烟草赤星病、烟草黑胫病、烟草青枯病、烟草病毒病等5类[3]，在31种烟草侵染性病害中真菌性病害有10种，且新的侵染性病害不断出现，如米根霉引起的烟叶霉烂病等[4]。　　福建省邵武市烟农在烟草种植中新发现一种病害，病株在茎部产生褐色水渍状病斑，严重部位腐烂，在叶部产生枯萎圆形斑点。试验室对发病株进行病原检测，本试验对其中的真菌进行了分离和鉴定。　　由于病原真菌物种间形态差异较小，鉴定工作较困难，而真菌rDNA-ITS适用于不同分类水平的物种鉴定及系统发育研究[5]，能从分子水平为病原菌的准确分类、鉴定提供科学依据。本试验选择ITS序列分析从烟草病害发生部位中分离出的真菌进行分析，从而达到快速、有效地鉴定。　　1 材料和方法　　1.1 材 料　　烟株：烤烟品种云32，邵武地区种植，发病后送检。　　孟加拉红培养基：北京奥康星生物技术有限责任公司；PDA培养基：北京奥康星生物技术有限责任公司；真菌基因组DNA快速抽提试剂盒：生工生物工程（上海）股份有限公司。改良马丁培养基配方（1 L）：蛋白胨5 g、酵母浸出粉2 g、葡萄糖20 g、磷酸氢二钾1.0 g、硫酸镁0.5 g， pH值 6.4，121 ℃灭菌20 min。　　1.2 试验方法　　1.2.1 病原菌分离与纯化 在送检的各样品中随机选取茎部3处病变部位切片。将每个切片放入100 mL无菌水中，摇床上充分振荡30 min，制成菌悬液，每瓶菌悬液取1 mL与一定量的孟加拉红培养基混匀制成平板，每瓶菌悬液制3个重复平板，28 ℃培养3～5 d。　　当培养出的菌落生长至直径1 cm时，用接种针挑取菌丝尖端植入另一皿PDA培养基内培养；再重复上述操作2～3次即可作为纯化菌种移入试管低温保存。　　1.2.2 真菌DNA提取 将试验菌株接种于PDA液体培养基中，28 ℃、200 r·min-1振荡培养2 d。过滤收集菌丝体，洗涤干燥，液氮研磨后转移至EP管中，使用试剂盒提取基因组 DNA 作为PCR反应的模板。琼脂糖凝胶电泳法检测DNA。　　1.2.3 ITS 序列扩增 真菌ITS区扩增通用引物为ITS-5（5-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3）和ITS-4（5-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3）。　　PCR反应体系为50 mu;L：DNA模板2 mu;L；10times;缓冲液5 mu;L；d NTP（每种2.5 mmol·L-1）2 mu;L；引物（10 mu;mol·L-1）各2 mu;L；Taq DNA 聚合酶（5 U·mu;L-1）0.4 mu;L；无菌水补足至50 mu;L。PCR反应程序为：95 ℃预变性5 min，然后94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35个循环，72 ℃延伸10 min。反应结束后取5 mu;L PCR产物加1 mu;L 6times;溴酚蓝上样缓冲液，在2%琼脂糖凝胶上110 V电泳35 min，凝胶成像仪拍照。　　1.2.4 ITS序列分析 测序交由生工生物工程（上海）股份有限公司进行，对所得序列进行BLAST分析[6]，采用Maximum Likelihood（ML）法构建系统发育树，Bootstrap 重复500 次检验各分支的置信度，最终确定菌株的分类地位。　　2 结果与分析　　2.1 菌株的分离纯化　　病原菌分离样品在PDA 培养基中28 ℃培养4 d后，有两种颜色大小和菌落形态特征上都存在差异的菌落，一种菌落在培养基上生长良好，初为白色菌落，后变为红棕色菌落，气生菌丝放射状生长；另一种形成底色黄、孢子多且黑的菌落。分别对这两种菌落进行纯化。　　2.2 ITS扩增后产物电泳　　提取这两种菌的DNA，以ITS-4和ITS-5为引物，进行PCR扩增，1%琼脂糖凝胶电泳检测，都获得了约600 bp的条带，与真菌ITS序列碱基大小范围一致。　2.3 BALST比对结果　　两分离菌株测序结果在Ncbi上进行BALST分析。1号菌株序列长度为542 bp，BLAST GeneBank数据库的基因序列显示，其与Fusarium kyushuense strain BBA78012（AF414971.1）和Fusarium kyushuense strain NRRL3509（U85544.1）同源性达99%，