重组大肠杆菌右旋糖酐蔗糖酶表达条件优化及其催化合成右旋糖酐的的分析研究.pdfVIP

重组大肠杆菌右旋糖酐蔗糖酶表达条件优化及其催化合成右旋 糖酐的研究 摘 要 右旋糖酐蔗糖酶(EC．2．4．1．5)能以蔗糖为底物，将D．葡萄糖基转移到正 在增长的葡聚糖链上形成高分子的葡萄糖聚合物右旋糖酐。右旋糖酐在医药、 化工、食品工业中都有重要的用途。工业生产右旋糖酐是发酵肠膜状明串珠菌， 通过加入蔗糖诱导产生右旋糖酐蔗糖酶。因为在原菌株中分离该酶比较困难不 利于研究该酶的催化性质，本实验将右旋糖酐基因克隆到大肠杆菌中并表达。 本研究分别以IPTG(异丙基一13一D一硫代半乳糖苷)和乳糖为诱导物，通 过设计正交实验，考察培养基中各成分及其浓度对诱导产酶结果的影响，成功 选择了适合不同诱导物可高效表达该酶的两种表达培养基。在选择了合适的培 养基之后，分别研究诱导条件的影响。用IPTG诱导时，其最佳条件为37℃菌 最佳条件为菌浓3．0，加入乳糖至1．0％继续诱导培养6h。从结果来看，乳糖诱 导效果不及IPTG的五分之一，但是对于工业生产乳糖诱导的低价和无毒则更 有价值。 硫酸铵沉淀、Ni．NTA亲和层析纯化，得到纯度较高的酶蛋白，并对纯酶进行 kDa， 了酶学性质及动力学研究。经过SDS．PAGE测得该酶的分子量约为170 与理论推测值基本相同。以蔗糖为底物，酶促反应的最适温度为25～30℃，最 5．O～8．0较为 适pH值为5．4，动力学常数Km值为10．43mmol／L；酶活在pH 降一半，但在35℃以上失活很快；O．5mol／L Ca2+对催化作用有较大的促进， 1．0mmol／L M92+有微弱的促进作用，Cu2+和SDS的抑制作用最强。 研究利用表达的重组右旋糖酐蔗糖酶以蔗糖为底物合成右旋糖酐，探讨温 度、蔗糖浓度和pH值对合成糖酐的影响。结果表明，底物转化率超过80％， 合成的糖酐多为大分子但溶解性很好。蔗糖浓度对右旋糖酐产率的影响最大， 其次是温度，影响最小的是pH值。研究对该酶合成右旋糖酐的分子量控制和 水解、乙醇划分进行了一些初步的研究，为该重组右旋糖酐蔗糖酶纯酶进行催 化反应和工业化应用提供了重要参数。 关键词：右旋糖酐蔗糖酶；表达；IPTG；乳糖：纯化；右旋糖酐 ‘ ‘ 。… 』、 ●● 一 ■‘ Culturec011ditionsforrecombinant UptimIZlng dextransucrasein and on coli production study dextran synthesis ABSTRACT molecular Dextransucrase(EC．2．4．1．5)synthesizehigh weightglucose dextran the moietiestoa chain polymer bytransferringD—glucosyl growingglucan sucroseas substrate．Dextranhasseveral inthe using importa