Math1诱导的哺乳动物的耳蜗再生毛细胞的形态学和功能学研究.pdf

复旦大学博士论文 _lathl诱导的哺乳动物的耳蜗再生毛细胞的形态学及 功能学研究 中文摘要 目的转录因子Mathl诱导了终末支持细胞向新生毛细胞的转分化。1)本实验在描 述支持细胞转分化为新生毛细胞的形态学变化过程的同时，通过使用正常毛细胞相 关特异性标记物，在形态学方面对新生毛细胞和正常毛细胞进行了比较；2)本实验 进一步阐述了在Mathl的作用下支持细胞转分化为毛细胞的转分化机制；3)本实验 在功能学方面对新生毛细胞与发育中的正常毛细胞进行了比较，探讨其是否已经具 备了正常毛细胞的功能性。 方法本实验使用了正常出生后3天的新生SD大鼠耳蜗进行体外器官培养，实验组 不同的时间点对培养组织进行固定，通过免疫荧光染色技术标记毛细胞相关特异性 蛋白来鉴定是否有新生毛细胞的产生，并描述了转分化的过程；其次，在耳蜗器官 培养过程中，通过采用了Brdu掺入法，探讨了支持细胞向新生毛细胞的转分化机 制；然后，通过检测新生毛细胞是否有摄取耳毒性药物新霉素， FMl—43的能力， 来验证是否存在毛细胞特征性的机械性门控通道；最后，我们采用Patch Clamp技 术，在不同的时间点对新生毛细胞的各种通道电流，动作电位以及特征性的机械门 控通道电流等在不同时间变化以及相关的动力学分析，验证Mathl诱导的新生毛细 胞是否已经具备了正常毛细胞的功能。 生毛细胞顶部的簇状静纤毛样结构；在对照组的耳蜗的大、小上皮嵴区域则未出现 这些现象；(虿)Brdu掺入实验表明，支持细胞向新生毛细胞的转分化过程为直接转分 化，不依赖于支持细胞的增殖；另外，Mathl的表达水平是诱导毛细胞分化的关键 因素；③imM的耳毒性药物新霉素能够引起异位新生毛细胞的死亡；从Mathl转染 4 复旦大学博士论文 后5天，部分新生毛细胞开始有能力对FMl-43的摄取，间接说明毛细胞能通过机械 钠电流，到第5天电流密度达最大，然后逐渐减小；对照组的支持细胞不表达钠电 流；⑤Mathl转染后三天，新生毛细胞开始表达钙电流，电流密度随着时间逐渐增 大；对照组支持细胞不表达钙电流；⑥Mathl转染后五天，新生毛细胞表达为快速 失活的延迟性钾整流，然后，表现为持续性基本不失活的延迟性钾整流，且电流密 度逐渐增大；而对照组的支持细胞仅表达持续不失活的幅度很小的延迟性钾整流； ⑦Mathl转染后五天，新生毛细胞表达了典型的HCN电流，且随着时间电流密度逐 渐减小，然后消失；⑧大多数的新生毛细胞上能记录到诱发的动作电位，极少数的 能记录到自发的动作电位：@Mathl转染后7天，我们记录到了新生毛细胞的机械门 控通道电流。 结论①利用了腺病毒转基因方式成功的建立了新生大鼠耳蜗体外培养在Mathl诱 导下产生异位新生毛细胞的模型；②新生毛细胞已经具备正常毛细胞样的形态，并 且表达许多相同的特异性相关蛋白；③支持细胞转分化为毛细胞的机制为直接转分 化，无需增殖后再转分化；④新生毛细胞有能力摄取耳毒性药物新霉素，FMl—43， 间接表明机械门控通道在新生毛细胞纤毛上的存在；⑤机械门控通道电流的出现， 在功能上标志了再生的毛细胞已经具备了毛细胞的特性；⑥各种通道电流，动作电 位在新生毛细胞上的有序出现，模拟了发育中的正常毛细胞的各种离子通道电流有 序出现的过程，证实了Mathl诱导的新生毛细胞是未成熟的、正在发育中的，具有 功能的毛细胞。 1瑚1-43，PatchClamp，离子通道，动作电位，机械门控通道： 【中图分类号】R764 hair。_。cell-like andfunctional of Morphological properties Mathl mRmmaliancochleainduced cellsin by