RNAi沉默整合素链接激酶基因对胰腺癌PANC-1细胞增殖的影响和其作用机制的研究.pdfVIP

三、论文 前言………………………………………………………………………………66日U百……………………………………………………………………………… 第一部分ILK基因干扰质粒的构建与鉴定……………………………………7 L 第二部分I K基因干扰质粒的转染及其干扰效率测定…………………一15 第三部分：转染ILK基因干扰质粒对Panc一1细胞增殖的影响……………30 结论……………………………………………………………………………．．33 四、本研究创新性自我评价………………………………………………………34 五、参考文献………………………………………………………………………35 六、附录 综述……………………………………………………………………………38 在学期间科研成绩……………………………………………………………50 致谢……………………………………………………………………………51 个人简历………………………………………………………………………52 ·中文论著摘要· RNAi沉默整合素链接激酶基因对胰腺癌PANC．1细 胞增殖的影响及其作用机制的研究 目 的 构建整合素链接激酶(ILK)基因RNA干扰(RNA interference，RNAi)表达载 体，研究其对胰腺癌PANC．1细胞ILK基因表达的抑制作用及其对胰腺癌细胞增 殖的影响。为研究胰腺癌的发病机制与治疗提供理论依据。 方法 设计三对针对ILK基因的小干扰RNA(smallinterferingRNA，siRNA)序列，并 根据该序列合成两条小发央RNA(smallhairpinRNA，shRNA)的DNA模板单链，同 时模板链两端分别设计不同的两个限制性酶切位点。退火形成siRNA载体插入片 断。用限制性内切酶将siRNA空载体线性化，T4连接酶将插入片断插入siRNA 空质粒中。经PCR和测序的方法鉴定重组质粒是否构建成功。通过阳离子脂质体 2000将重组质粒和阴性对照质粒转入人胰腺癌细胞株Panc．1细胞 Lipofectamine 中，G418筛选4周后以绿色荧光蛋白(GFP)基因为报告基因，用荧光显微镜观 察质粒表达效率。挑选阳性单克隆继续在G418压力下扩大培养4周后，再以GFP 基因为报告基因，用流式细胞仪和荧光显微镜观察质粒表达效率。应用半定量 RT．PCR方法，检测胰腺癌PANC．1细胞中ILKmRNA表达水平，应用Western．Blot 方法，检测胰腺癌PANC．1细胞中ILK基因蛋白表达水平。筛选出干扰效率最高 的重组质粒。M玎筅黔：每组约2,000细胞接种96孔细胞培养板上，在37℃、5％C02 染液，在37。C、5％C02的培养箱中培养4 h后离心，再加入二甲基亚砜150I_tL／ 三组细胞的生长情况。 当日7尺结果 重组质粒构建结果：经PCR及测序鉴定确定重组质粒构建成功。 干扰效率检测结果：重组质粒转染Panc．1细胞后，ILK基因表达被有效地抑 制，干扰效率为74．61％，ILK蛋白的抑制效率为54．66％。 MTT实验结果：在0、24h时，三组细胞的A570值没有明显差别；在48、 作处理的Panc．1细胞的A570值明显减小(P0．01)。 宝口结论◆匕 成功构建了ILK的干扰质粒。ILKsiRNA表达质粒能有效抑制胰腺癌Panc．1 细胞ILK的表达。同时，Pane．1细胞的增殖能力1F降。提示ILK基因与胰腺癌细 胞的恶性行为密切相关可以作为治疗胰腺癌的靶点，其作用机制与细胞信号传导 通路有关。RNA干扰是肿瘤基因治疗的有效手段。 关键词 blot；基因治 疗。 2 ·英文论著摘要· Effectsan