RNA干扰介导ABCE1基因沉默对人肺腺癌的影响和其下游差异基因的筛选.pdfVIP

·中文论著摘要· RNA干扰介导ABCEl基因沉默对人肺腺癌的影响及 其下游差异基因的筛选 刖 吾 肺癌是呼吸系统常见肿瘤，腺癌是肺癌最主要的组织学类型之一，发病机制 目前仍未明确。尽管早期诊断、早期治疗取得了很大进展，但手术后仍有许多患 者死于复发和转移。肺癌组织中某些生物学标志物的表达可能影响患者的预后， 而根据这些特殊标志物的表达情况采取的治疗措施可能改善患者的预后，因此， 寻找新的肿瘤分子标志物用于肺癌的早期诊断、监测病情进展、指导治疗是目前 一个研究热点。 我们课题组前期在田大力教授的指导下，应用mRNA荧光差异显示法筛选肺 癌发生转移相关基因的研究发现了与ABCEl基因高度同源的片段，后通过RACE 法明确为ABCEl基因。以往对ABCEl的研究，主要集中在干扰素介导的 2-5A／RNaseL细胞抗病毒通路中。ABCEl作为该通路核心酶RNaseL(核糖核酸 酶L)的抑制剂，参与通路的调控。而后的研究发现ABCEl属于高度保守的序列， 在真核及原核生物细胞内普遍表达，然而，在真核生物界外未发现干扰素的存在， 这提示ABCEl还存在其它重要功能。最近的研究表明，ABCEl蛋白通过与翻译 起始因子elF2a和elF5的结合在mRNA翻译的起始过程中发挥着必要的作用。体 外实验中，在人类肿瘤细胞株中抑制ABCEl的表达，可阻碍肿瘤细胞的生长。 如上所述，在肺腺癌的发生、发展过程中是否有ABCEl的参与?在这一演变 过程中ABCEl发挥什么作用?目前还不清楚。因此，以此为切入点，本研究我们 将探讨ABCEl基因在肺腺癌演变过程中的作用及其机制。 论文一：ABCEl在肺腺癌组织细胞中的表达 及临床意义 我们收集18例肺腺癌组织、15例转移淋巴结组织标本和17例癌旁肺组织标 分期中mRNA和蛋白的表达，结合临床资料，探讨ABCEl与肺腺癌发生发展的 关系和临床意义。同时我们用RT—PCR方法检测ABCEl基因在人肺腺癌细胞 株A549中是否存在表达。结果显示三种组织中均存在ABCEl的表达；肿腺癌组 胞中存在ABCEl的表达。研究结果提示ABCEl基因可能参与了肺腺癌的形成和 演变，其表达水平在一定程度上可以反映肺腺癌的转归，有望成为新的肿瘤分子 标志物用于肿瘤的早期诊断、病情检测和预后评估。 论文二：RNA干扰介导ABCEl基因沉默对人肺腺癌 A549细胞增殖的影响 RNA干扰技术是近几年迅速发展起来的基因阻断技术，将与目的基因同源的 小片段双链RNA分子导人细胞内，进而特异性的降解目的基因的mRNA，是基 因诊断、基因治疗的有利工具。我们根据文献选择ABCEl基因cDNA序列中71bp 的核苷酸序列为RNA干扰的靶序列，选择了表达绿色荧光蛋白、对肺腺癌A549 的质粒，经包装细胞包装后制备可表达ABCEl基因特异性siRNA的载体病毒颗 粒，直接感染人肺腺癌A549细胞以阻断细胞ABCEl基因的表达。筛选出稳定表 2 达pSC--ABCEI的细胞株。用Western 通过下调ABCEl在肿瘤细胞内的表达水平，来阐明ABCEl在肿瘤细胞中的作用。 细胞的增殖受到抑制。实验结果结合文献提示ABCEl基因通过抑制翻译起始复合 物的形成，而在细胞增殖中发挥生物学作用，ABCEl基因可能是肺腺癌基因治疗 的有效靶点，RN越可以成为基因治疗的有力工具． 扰后基因表达谱的差异分析 为进一步明确ABCEl基因的作用机制，我们采用基因芯片技术研究了SiRNA WG—V3 公司Human KIT基因表达芯片，将实验样品荧光标记，芯片 Beadchip 杂交后，Illumina Reader软件进行图象分析。结果：差异明显表达的基因 BeadArray 行检索后初步分类，有405个功能分类基因，大致分为免疫炎症反应基因、信号 传导基因、代谢相关基因、细胞增殖、发育、分化相关基因、凝血相关基因、蛋 白质转录、翻译、修饰相关基因、细胞黏附和凋亡相关基因12个功能分类。45 个未分类基因，46个未知基因表达序列。提示ABCEl可能通过影响其下游基因 的表达变